[發(fā)明專利]一種檢測傳染性喉氣管炎病毒的液相芯片方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210337807.5
• 申請日: 2012-09-12
• 公開（公告）號: CN102851395A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發(fā)明（設計）人: 王慧煜;韓雪清;林祥梅;梅琳;李志輝
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C40B40/06;G01N21/64
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及分子生物學領域，特別是涉及用液相芯片的方法檢測傳染性喉氣管炎病毒的方法。?

背景技術(shù)

傳染性喉氣管炎(Infectious?laryngotracheitis，ILT)是由皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）引起的一種急性、接觸性上呼吸道傳染病，以呼吸困難、咳出血樣粘液、喉部和氣管黏膜水腫出血繼而糜爛為主要特征。由于引起產(chǎn)蛋下降和雞群死亡而造成嚴重的經(jīng)濟損失，并且該病可感染各種日齡和品種的雞。本病通常突然暴發(fā)，并很快在雞群中傳播，感染率約為90%~100%，致死率5%~70%，一般在10~20%之間。May等1925年在美國首次報道該病，現(xiàn)已遍及世界許多養(yǎng)雞地區(qū)。我國自50年代以來大部分地區(qū)有不斷發(fā)生的報道，多呈地方流行性，并且發(fā)病的日齡有提前的趨勢。最早發(fā)病可見20-40日齡，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴重損失，是集約化養(yǎng)雞場的重要疫病之一。?

目前傳染性喉氣管炎的實驗室診斷主要是病毒分離、血清學診斷、酶聯(lián)免疫吸附試驗、核酸探針、聚合酶鏈式反應等。病毒分離、血清學診斷和酶聯(lián)免疫吸附試驗這些方法雖然經(jīng)典，但費時費力且敏感性差，不能檢測亞臨床感染，而傳染性喉氣管炎亞臨床感染占有重要地位。PCR技術(shù)雖具有快速、特異、敏感和易于操作的特點，在畜禽傳染病的檢測、鑒別診斷方面得到了廣泛應用但是不能進行高通量檢測，不能滿足高通量檢疫的要求，更不利于大量通關樣品的檢疫和疫情暴發(fā)時大批量樣品的緊急篩查，因而需要建立一套簡便、快速、準確的傳染性喉氣管炎篩查和檢驗技術(shù)，以滿足日常檢測的要求。?

液相芯片（xMAP）技術(shù)是20世紀90年代中期發(fā)展起來的高通量檢測技術(shù)。它是既可進行免疫學檢測也可進行核酸檢測的一種集流式技術(shù)、激光、熒光微球和數(shù)字信號處理為一體的新型生物分子高通量多重檢測技術(shù)。液相芯片技術(shù)最突出的優(yōu)點在于僅需少量樣本即可同時定性、定量檢測同一樣本中的多種不同目的分子，即多重檢測。具體說來，與常規(guī)免疫學或核酸檢測方法相比，它具有高通量、樣品需求量小、操作簡單、靈敏度高、檢測范圍廣、特異性強、重復性好的顯著優(yōu)點。?

液相芯片技術(shù)平臺是既能保證信息質(zhì)量，又能提供相對高通量的新一代分子診斷技術(shù)平臺，這個技術(shù)平臺整合了生物檢測，微球熒光編碼，微液體傳送系統(tǒng)，激光實時記錄，先進電腦軟件和數(shù)據(jù)處理模式等多種先進技術(shù)。液相芯片的核心技術(shù)是把微小的微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼）。應用時，把針對不同檢測物的微球混合后再加入微量待檢測標本，在懸液中與微粒進行特異性地結(jié)合。結(jié)合的結(jié)果可以在瞬間經(jīng)激光判定后由電腦以數(shù)據(jù)信息的形式記錄下來。因為分子雜交是在懸浮溶液中進行，檢測速度極快，所以又有“液相芯片”之稱。?

液相芯片技術(shù)平臺具有高效性：因為上百種顏色的微球可以在同一個反應體系內(nèi)，所以一小份標本（血，或其它體液，組織）可以被用來同時檢測上百個生理或病理指標。液相芯片技術(shù)平臺具有高敏感性：每個乳膠微球上都可以滿滿地（以共價鍵牢固結(jié)合的方式）包被上抗原、抗體、或核酸。因為探針密度高，產(chǎn)生的信號強，加上使用熒光檢測，所以敏感性大大高于任何現(xiàn)有分析、診斷方法，也高于其它芯片法。液相芯片技術(shù)平臺是一種快速檢測方法：因為雜交在懸浮的液相中進行，所以反應需要時間短，雜交后常不用清洗就可以直接讀數(shù)，且檢測效率大大高于固相雜交，所用時間從幾?小時縮短到十幾分鐘。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測傳染性喉氣管炎病毒的液相芯片方法；本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測傳染性喉氣管炎病毒的液相芯片試劑盒。?

查閱相關文獻皰疹病毒的TK基因是高度保守的，ILTV不同毒株之間更加保守，英國株(Throne)和美國株(632株)TK基因僅相差3個連續(xù)的核苷酸。從GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中收集傳染性喉氣管炎TK基因序列，利用Bioedit分子生物學分析軟件對大量收集的序列進行分析比較，根據(jù)實驗目的篩選傳染性喉氣管炎的特異性保守序列。?

本發(fā)明在對序列分析的基礎上，根據(jù)篩選的每個亞型的保守序列，參照GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中發(fā)表的傳染性喉氣管炎TK基因序列組序列（登錄號：EF552574），應用DNAStar、Primer5.0、和Bioedit軟件分別對其進行初步分析篩選，設計了傳染性喉氣管炎的特異性引物和探針，分別對下游引物進行生物素標記，對探針進行氨基修飾。?