[發明專利]一種極耐熱木糖苷酶及其編碼基因和應用

無效

• 申請號: 201210333818.6
• 申請日: 2012-09-11
• 公開（公告）號: CN102864132A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 王飛;時號;李迅;錢方軍
• 申請（專利權）人: 南京林業大學;沭陽祥泰生物能源科技有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N15/10;C12P19/14
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

技術領域

本發明屬于基因工程技術及纖維原料水解領域，具體涉及一種極耐熱木糖苷酶及其編碼基因和應用。

背景技術

木聚糖是植物細胞壁半纖維素的土要成分，是除纖維素之外自然界中最為豐富的可再生資源之一。木糖就存在于半纖維素多縮戊糖中,?是亟待開發的重要可再生資源。如果將半纖維素生物降解為木糖和少量其它單糖,?可以用作基本碳源生產各種發酵產品、工業酒精及糠醛制備等。同時,?木糖的衍生物木糖醇還可作為食品添加劑，如用于口香糖、糖果及于尿病患者的甜味劑等。

木糖苷酶是木聚糖降解酶系中的較為關鍵的多糖水解酶，通過隨機切割木寡糖的β-1,4-糖苷鍵，將木寡糖降解為木糖。由于木糖苷酶可以將寡糖降解為木糖，因此可作為一種高效的工業酶制劑用于木糖及木糖衍生物的生產，因此具有潛在的應用價值。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種極耐熱木糖苷酶，以使其滿足使用要求。本發明的另一目的是提供一種編碼上述極耐熱木糖苷酶的核苷酸序列。本發明還有一目的是提供上述一種極耐熱木糖苷酶的應用。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種極耐熱木糖苷酶，氨基酸序列如SEQ?NO：1所示。

一種極耐熱木糖苷酶，氨基酸序列為權利要求1所述的SEQ?NO：1序列中的氨基酸經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木糖苷酶活性的衍生蛋白質。

一種編碼上述的極耐熱木糖苷酶的基因，?DNA序列如SEQ?NO：2所示。

一種可表達上述的極耐熱木糖苷酶的重組體系，在所述的重組體系上克隆有如SEQ?NO：2所示的DNA序列；所述的重組體系包括重組質粒和重組菌。

一種擴增上述的編碼極耐熱木糖苷酶的基因的方法，所使用的引物對為：

Xylo-1：5’-?GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’；

Xylo-2：5’-CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’。

上述的極耐熱木糖苷酶在酶解木寡糖中的應用。酶解反應溫度為75-100℃，pH5.0-7.5。所述的木寡糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括木二糖、木三糖和木四糖。

上述的重組體系在酶解木寡糖中的應用。

上述的極耐熱木糖苷酶在酶解玉米秸稈的木寡糖中的應用。

有益效果：與現有技術相比，本發明所提供的木糖苷酶具有優良的耐熱性能。在95℃、pH為6.0的條件下酶活性最高，比酶活達到117.6U/mg；該蛋白酶在溫度為75-100℃、pH為5.0-7.5的范圍內，均具有較高的酶活。該木糖苷酶的耐熱性能極高，在85℃反應體系中，保溫1h?酶活性基本保持不變。上述特性使得本發明得到的木糖苷酶比現有木糖苷酶具有更大的優越性，適用于80℃以上高溫、偏中性的pH條件下木寡糖的降解，具有潛在的工業應用價值。

附圖說明

圖1是木糖苷酶Tth?xylo的SDS-PAGE蛋白電泳圖；

圖2是Tth?xylo的最適溫度結果圖；

圖3是Tth?xylo的最適pH結果圖；

圖4是Tth?xylo的熱穩定性結果圖；

圖5是Tth?xylo降解玉米秸稈半纖維素TLC圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。

以下實施例中所使用的材料、試劑等，若無特殊說明，均可從商業途徑獲得。

實施例1?嗜熱陸地熱泉高溫神袍菌基因組DNA的提取

采用嗜熱陸地熱泉高溫神袍菌Thermotoga?thermarum?DSM5069（購自德國微生物菌種保藏中心）新鮮菌體10g，懸于5mL?50mM?Tris緩沖溶液中（pH8.0），混勻后在37℃放置20min，然后加入2mL?10%SDS，55℃放置5min，用等體積的酚-氯仿（24:1）抽提一次，取上清液加入2倍體積的無水乙醇，于-20℃放置30min，4℃?13000rpm離心20min，收集沉淀。沉淀溶于0.5mL?TE緩沖液（pH8.0，10mM?Tris，1mM?EDTA），加入10mg/mL?RNase?3μL，37℃保溫1h，用等體積的酚-氯仿（24:1）抽提一次，取上清加入2倍體積的無水乙醇，于-20℃放置30min，4℃?13000rpm離心20min，收集沉淀，真空冷凍干燥，用0.5mL超純水溶解。