[發明專利]用于修復石油污染土壤的微生物的固定化方法

無效

• 申請號: 201210331365.3
• 申請日: 2012-09-07
• 公開（公告）號: CN102876655A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 張秀霞;耿春香;趙朝成;秦麗姣
• 申請（專利權）人: 中國石油天然氣股份有限公司;中國石油大學（華東）
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;B09C1/10
• 代理公司: 北京市中實友知識產權代理有限責任公司 11013
• 代理人: 趙東冶

技術領域

本發明涉及一種用于修復石油污染土壤的微生物的固定化方法，該方法屬于微生物固定化技術，具體地說是一種用于修復石油污染土壤的固定化微生物的固定化方法。

背景技術

石油污染土壤是石油及石化企業的重要污染之一，其中的石油污染物對人體及環境具有很高的毒害作用。國內外石油污染土壤的處理方法主要有：焚燒法、填埋法、堆放法以及生物修復法等。

微生物修復技術的核心是高效降解菌對石油污染物的降解作用，降解過程使污染物的成分趨向于更復雜，一些次生代謝物和中間降解產物的毒性更大，游離微生物修復作用的不足就逐漸顯現出來，如單位體積內有效降解菌濃度低、與土著菌競爭處于弱勢、抗毒性侵害能力差等。而微生物固定化技術可以克服這些缺點和弊端，使修復效果得到大大改善。

微生物固定化技術是20世紀80年代興起的一種新型生物技術，是指將游離的細胞(微生物)或酶定位于限定的空間區域內，并使其保持活性且能反復使用的技術。盡管微生物固定化技術被廣泛用于修復受污染的流體介質(如廢水)和半流體介質(如泥漿)環境中，但將其應用于修復受石油污染的非流體介質（如土壤）的研究，國內外報道較少。

限制固定化微生物在土壤修復中應用的主要原因是土壤非流體介質本身所具有的復雜性和特殊性，給該技術提出了許多不同于在流體介質中應用固定化技術時所面臨的科學問題，如固定化技術本身存在著不足，如未開發出適用于非流體介質的固定化技術，未開發出廣譜性的固定化技術，尚未解決混合菌的固定化問題，而且缺乏對固定化顆粒的環境安全性評價和對固定化過程中環境因子調控的系統研究；固定化微生物顆粒的載體選擇，如何克服在土壤中固定化顆粒的不可回收性和污染物濃度的非均質性對固定化顆粒造成的沖擊；如何保證吸附法制備的固定化微生物的菌濃度。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提出一種用于修復石油污染土壤的微生物的固定化方法，以解決目前土壤修復過程中的高成本低效率、菌濃不足、引入二次污染這些不足；且天然植物材料可以作為土壤的疏松劑、為微生物修復土壤提供營養物質，為廢棄材料的資源化利用提供一條有效的途徑。

本發明解決其技術問題所采取的技術方案是：用秸稈材料做載體，在最佳吸附時間、溫度、載體量的條件下，將微生物吸附在秸稈載體上進行固定化，具體按以下步驟實現：

1．篩選高效石油降解菌從受石油污染的土壤中篩選石油降解菌，得到一株降解率為23％的單菌SM-3，該菌為桿狀菌，測定該菌的生長曲線，該菌株的對數生長期為5-16h，穩定期為16-25h；

2．以勝利原油為反應底物，測定該原油的標準曲線，用以計算降解率；

3．選擇秸稈材料為固定化載體，將秸稈粉碎，過80目篩。

4．取粉碎后的秸稈材料3％-5％（V/V）壓實后裝入一定體積的反應釜中，用121℃高壓水蒸汽滅菌20min，然后將用牛肉膏蛋白胨液體培養基活化16h后的密度為1×10¹⁰-5×10¹⁰個/mL的菌液SM-3按20％（V/V）接到反應釜中，于30～40℃恒溫固定12～24h；

固定化所用到的菌為SM-3，將該菌用牛肉膏蛋白胨液體培養基培養至對數生長期和穩定期交界點（16h），其游離狀態下對原油的降解率為23％；

所述牛肉膏蛋白胨液體培養基的配方為：NaCl?1％（m/m），蛋白胨1％（m/m），牛肉膏0.5％（m/m）和一定體積的蒸餾水混合均勻，以pH試紙為指示，用NaOH或鹽酸調節調節pH7.0，121℃水蒸氣滅菌20min。

5．把固定了菌的3％-5％（V/V）載體連帶未被固定的菌液一起轉移到離心杯中，在1000r/min下離心10min，倒掉上層菌液，將下層載體無菌操作完全轉移至事先準備好的原油培養基中，30℃恒溫降解7d，降解率可達到60％，比游離菌提高近40％；