[發明專利]含有木爾坦棉花曲葉病毒侵染性克隆的農桿菌菌株及其應用

無效

• 申請號: 201210326834.2
• 申請日: 2012-09-06
• 公開（公告）號: CN102816730A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 周雪平;謝艷;顧周杭
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/84;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明所屬的領域為生物工程領域，尤其是涉及一種含有木爾坦棉花曲葉病毒侵染性克隆的農桿菌菌株及其應用。

背景技術

棉花曲葉病（Cotton?leaf?curl?disease,?CLCuD）是一種嚴重為害棉花生產的病害。CLCuD的寄主范圍較廣，不僅為害棉花，還可為害錦葵科的蜀葵、海島棉、陸地棉、黃秋葵、扶桑和黃槿，以及茄科的辣椒、龍葵和葫蘆科的西瓜、絲瓜。其實驗寄主包括棉花、煙草、番茄、木槿、黃秋葵和藿香等。自1978年最早在蘇丹發現CLCuD以來，CLCuD一直是影響巴基斯坦地區棉花產量的主要病害。棉花曲葉病由煙粉虱傳播，主要產生植株葉片卷曲、葉脈膨大、葉背面耳突增生、植株矮化，感病植株一般只有健康株高度的40％～60％，棉鈴少結或不結，棉纖維低產，嚴重時絕收等典型癥狀。

至今鑒定的引起棉花曲葉病的病原有7種，這7種病毒主要分布于亞洲及非洲，其中木爾坦棉花曲葉病毒(Cotton?leaf?curl?Multan?virus,?CLCuMV)是引起棉花曲葉病的主要病原。CLCuMV為雙生病毒科（Geminiviridae）中的菜豆金黃花葉病毒屬（Begomovirus）病毒，具有典型的雙聯體顆粒形態，大小約18～20?nm×30?nm，基因組為單鏈環狀DNA。CLCuMV是一類由DNA?A和衛星DNAβ形成的病害復合體。

植物病毒基因組一般較小，易于進行遺傳操作而且感染過程簡單，可以廣泛應用于植物反向遺傳學的研究。要建立一套完整的基于植物病毒的反向遺傳學手段，首先要構建病毒的侵染性克隆，進而利用突變、缺失、插入、置換等分子生物學手段對病毒基因組進行功能區域的定位，從而能在寄主植物表型水平上反映和評價基因功能的表達。基于植物病毒的侵染性克隆主要有以下兩方面的作用。首先，利用植物病毒載體在宿主植物體內進行蛋白質的過量表達，第二，利用植物病毒載體通過RNAi（RNA?interference）技術，在宿主植物體內進行有目的的基因沉默的研究。RNAi技術最早于1998年在矮牽牛中發現，于2002年被《科學》雜志評為當年十大科學突破。植物細胞能特異識別外源RNA，通過RDR6等蛋白的作用，將外源單鏈RNA復制產生雙鏈RNA（dsRNA）后，引發其降解。降解產生的次級小RNA（siRNA）又可以作用于其同源的序列，使得沉默信號發大。利用這一原理，在植物病毒載體上插入一段植物內源的基因就可以特異沉默植物的內源基因，從而通過反向遺傳學的手段對植物基因組進行研究。

發明內容

本發明的目的是提供一種含有木爾坦棉花曲葉病毒侵染性克隆的農桿菌菌株及其應用。

含有木爾坦棉花曲葉病毒侵染性克隆的農桿菌菌株，保藏號為CGMCC?No.5930，能產生木爾坦棉花曲葉病毒的侵染性克隆。

??所述的能產生木爾坦棉花曲葉病毒的侵染性克隆的構建方法為：利用分子生物學方法將1.9個正向重復的木爾坦棉花曲葉病毒全長基因組DNA和1.8個正向重復的衛星DNAβ構建到同一個高效植物表達載體pCambia2300上，得到木爾坦棉花曲葉病毒侵染性克隆。

??所述的含有木爾坦棉花曲葉病毒侵染性克隆的農桿菌菌株用于木爾坦棉花曲葉病毒的致病性分析、病毒基因功能研究。

所述的木爾坦棉花曲葉病毒侵染性克隆用于外源基因的表達及沉默內源基因來研究植物基因組功能。

本發明的有益效果是：1）提供的農桿菌菌株可以大量產生木爾坦棉花曲葉病毒的侵染性克隆；2）利用本發明提供的侵染性克隆能高效侵染本氏煙、普通煙和三生煙等多種模式植物，無需昂貴的儀器、操作簡單、重復性好；3）利用本發明提供的侵染性克隆可有效用于木爾坦棉花曲葉病毒的致病性分析、病毒基因功能研究；4）利用本發明提供的侵染性克隆可以改造成病毒表達載體；5）利用本發明提供的侵染性克隆用于外源基因的表達和通過沉默內源基因來研究植物基因組功能。

附圖說明

圖1.?pCambiaAβ-PDS誘導本氏煙PDS基因沉默表型；

圖2.實時定量PCR檢測pCambiaAβ-PDS浸潤本氏煙內源PDS沉默效率；

圖3.?pCambiaAβ-CP4EPSP浸潤本氏煙抗草甘膦表型。

具體實施方式