[發明專利]一種恢復間充質干細胞全能性的方法有效

申請號：	201210326437.5	申請日：	2012-09-06
公開（公告）號：	CN103667186A	公開（公告）日：	2014-03-26
發明（設計）人：	吳耀炯;郭玲;周瑩	申請（專利權）人：	清華大學深圳研究生院
主分類號：	C12N5/0775	分類號：	C12N5/0775
代理公司：	北京紀凱知識產權代理有限公司 11245	代理人：	關暢
地址：	518055 廣東省深圳***	國省代碼：	廣東;44
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種恢復間充質干細胞全能性方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種恢復間充質干細胞全能性的方法。

背景技術

間充質干細胞（mesenchymal?stem?cells,MSCs）是一種成體干細胞，因其具有強大的增殖能力和多向分化潛能，免疫原性低，來源方便，易于分離、培養、擴增和純化等優點，使其在自身免疫性疾病以及各種替代治療等方面具有廣闊的臨床應用前景。盡管骨髓中間充質干細胞含量相對較多，但僅占0.001%～0.01%，難以滿足細胞治療的需要，故需要在體外分離純化，培養擴增才能滿足要求。但是，MSCs在體外擴增過程中衰老和向成骨細胞自主分化問題嚴重影響其治療效果和使用安全性。

保持MSCs原有特性的關鍵在于改進MSCs的培養條件。MSCs在體內是處在一種立體環境，因此，有人提出三維培養的設想。1998年，Qiu對鼠骨髓基質細胞進行三維培養，掃描電鏡檢測發現微載體cytodex-3表面大量細胞覆蓋，并相互橋接在一起，組成了三維多細胞聚合物。聚合物中可見礦化結節，免疫組化染色可見堿性磷酸酶和1型膠原（Qiu?Q,Ducheyne?P,Gao?H,Ayyaswamy?P.Formation?and?differentiation?of?three-dimensional?rat?marrow?stromal?cell?culture?on?microcarriers?in?a?rotating-wall?vessel.Tissue?Eng.1998;4:19-34.）。Glowacki用膠原海綿作為載體進行三維灌注培養，減少了代謝產物的聚集，結果發現細胞外基質含量提高，所培養的細胞活性和功能均加強（Glowacki?J,Mizuno?S,Greenberger?JS.Perfusion?enhances?functions?of?bone?marrow?stromal?cells?in?three-dimensional?culture.Cell?Transplant.1998;7:319-26.）。但cytodex-3和膠原海綿均為實心載體，比表面積較小，細胞難以大規模擴增。而大載體生物反應器能否用于MSCS的擴增培養，還有待于一些問題的順利解決，如大孔微載體的研制、細胞與載體的粘附、貼壁細胞的洗脫等。

目前的3D培養都不能滿足目前細胞工程和基因工程對種子細胞量的需求而形成產業化，而且，3D培養是否從根本上恢復了MSCs多能性目前尚未有研究。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種恢復間充質干細細胞全能性的方法。

本發明提供的方法，包括如下步驟：

1）將全能性降低的離體間充質干細胞懸滴培養，得到懸滴培養后的細胞；

2）將所述懸滴培養后的細胞繼續懸浮培養，實現恢復所述全能性降低的離體間充質干細胞全能性。

上述方法中，步驟1）中，所述全能性降低的離體間充質干細胞為將離體間充質干細胞經體外擴增得到的間充質干細胞。

其中，上述離體間充質干細胞可來源于任何人體或動物組織和體液，如胎盤、臍帶、骨髓、脂肪和/或臍帶血等，而且該離體間充質干細胞的全能性是完好的。

上述全能性降低的離體間充質干細胞可為任何原因所致，如體外擴增培養所致，包括體外培養體系原因或傳代等因素；本發明的實施例中，上述全能性降低是由體外擴增培養導致，具體為傳代培養4-10代；所述傳代培養具體采用貼壁培養的方式。

上述全能性降低的離體間充質干細胞的特征體現在：與離體間充質干細胞相比，細胞的體積變大、形狀由梭形變成不規則形、胞質的透明度增高、自主向成骨細胞分化、干細胞相關基因Oct4、Sox2、Nanog表達量下降。

上述方法中，步驟1）中，

所述懸滴培養包括如下步驟：將所述全能性降低的離體間充質干細胞懸浮，得到細胞懸液；再將所述細胞懸液滴加在培養皿蓋上，再將滴加后的蓋倒置在培養皿底上，培養，得到懸滴即為懸滴培養后的細胞；所述細胞懸液的濃度具體為10⁴-10⁸個/mL。