[發明專利]大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy及其重組蛋白

無效

• 申請號: 201210322516.9
• 申請日: 2012-09-03
• 公開（公告）號: CN102787131A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 韋秀梅;劉相全;楊嘉龍;楊建敏;王忠全
• 申請（專利權）人: 山東省海洋水產研究所
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/64;A61K38/48;A61P31/00;A61P35/00
• 代理公司: 北京世譽鑫誠專利代理事務所(普通合伙) 11368
• 代理人: 郭官厚

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體講是從大竹蟶cDNA文庫中獲得一種糜蛋白酶基因SgChy的全長cDNA序列，對其結構域進行了重組表達，并分析了該重組產物的糜蛋白酶活性。

背景技術

絲氨酸蛋白酶(serineprotease)家族包括諸多成員，它們參與消化、凝血、免疫反應、信號轉導、激素激活和發育等過程。糜蛋白酶(chymotrypsin)是絲氨酸蛋白酶中的一種，能切斷蛋白質肽鏈中酪氨酸和苯丙氨酸的羧端肽鏈，從而有效酶解蛋白質，在蛋白消化中發揮著重要的作用。糜蛋白酶在現存物種中廣泛存在。目前為止，糜蛋白酶的研究主要集中在哺乳動物中，近年來，陸續出現了有關魚類和海洋無脊椎動物中糜蛋白酶的研究報道，研究者從草魚、鯽魚和凡納濱對蝦、扇貝的消化腺，鯉魚的胰腺，鱈魚和虹鱒的幽門和以及鳀魚內臟團中分離鑒定出糜蛋白酶，其中對于海洋脊椎動物尤其是海洋魚類糜蛋白酶的研究報道較多，而在海洋無脊椎動物中相關研究比較少，未見關于大竹蟶糜蛋白酶的報道。本發明對于大竹蟶糜蛋白酶基因的克隆、編碼蛋白的重組以及重組蛋白的酶活性分析，填補了大竹蟶糜蛋白酶研究領域的空白。

糜蛋白酶作為一種能分解變性蛋白質的蛋白水解酶，具有重要的藥用價值。糜蛋白酶能清創消腫和去除壞死組織的作用，在對于各種炎癥、炎性水腫、血腫、潰瘍及血栓等有較好的療效，可用于創傷或手術后傷口愈合、抗炎、防止局部水腫、積血等；同時，還能促進抗癌藥物向病灶滲透，具有一定的抗癌增效作用，可在局部大劑量使用，治療乳腺癌、宮頸癌和胃癌等多種腫瘤，無任何毒副作用或不良反應。目前國內獲得糜蛋白酶多采用從牛胰或豬胰中經多重結晶結合透析法提取，該方法復雜、耗時長、純化能力弱。本發明克隆了新的大竹蟶糜蛋白酶基因，對其編碼的蛋白進行了重組表達，獲得了具有酶活性的重組蛋白，為生產糜蛋白酶提供了新思路，也為開發新的天然海洋藥物奠定了理論基礎。

發明內容

本發明的目的是要填補有關大竹蟶糜蛋白酶研究的空白，克隆大竹蟶糜蛋白酶基因，對其結構域進行體外重組并分析其重組蛋白的活性，為開發天然的海洋藥物奠定基礎。

本發明的目的是由以下技術方案實現的:克隆得到了一種大竹蟶糜蛋白酶基因，該基因具有SEQ?ID?No：1中的核苷酸序列，該序列全長1186bp，5’非編碼區262bp，3’非編碼區186bp，有多聚腺苷酸尾巴，開放閱讀框738bp，編碼245個氨基酸；氨基酸序列如SEQ?ID?No：2中所示，成熟肽分子量為27.1kDa，等電點為6.08；無信號肽，具有1個保守的Tryp?SPc結構域。該基因編碼蛋白的重組產物具有糜蛋白酶活性。

一種克隆大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy并制備其重組蛋白的方法，所述的方法是從構建的大竹蟶cDNA文庫中，利用現代分子生物學技術分析得到糜蛋白酶基因的EST序列，將對應的質粒轉化后測序得到基因cDNA全長，以原核表達的方法構建其重組質粒，誘導表達重組蛋白，重組蛋白經純化和復性后檢測其糜蛋白酶活性。

本發明的優點：克隆了一種大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy的cDNA全長，該基因具有SEQ?ID?No：1中的堿基序列，體外重組了該基因的編碼蛋白，其具有SEQ?ID?No：2中的氨基酸序列，該重組蛋白具有糜蛋白酶活性。該基因及其重組蛋白活性的研究，對于研制天然海洋消炎和抗癌藥物具有潛在的應用價值。

本發明的實施例結合實驗及說明書核苷酸序列表進一步說明如下：

SEQ?ID?No：1為大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因的核苷酸序列。

SEQ?ID?No：2為大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因編碼蛋白的氨基酸序列。

具體實施方式

本發明的大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因具有SEQ?ID?No：1的堿基序列，其編碼蛋白具有SEQ?ID?No：2的氨基酸序列，該重組蛋白具有糜蛋白酶活性。

本發明的SgChy的基因克隆及其蛋白重組方法如下：

實施例1：

所述的SgChy的基因克隆方法：