[發(fā)明專利]芝麻栽培種與Sesamum radiatum野生種遠(yuǎn)緣雜交后代的分子鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210318496.8
• 申請(qǐng)日: 2012-08-31
• 公開（公告）號(hào): CN102965431A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張海洋;苗紅梅;張?bào)w德;魏利斌;李春;琚銘;王慧麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.檢測(cè)芝麻栽培種與Sesame?radiatum野生種遠(yuǎn)緣雜交后代的的SSR引物，包括：

引物對(duì)HS209

正向引物序列：5’-GCAAGAAGCCGACATGTTTA-3’（Tm=53.35℃）

反向引物序列：5’-ACTCCAATTCCTCCACCAAG-3’（Tm=55.4℃）。

2.一種如權(quán)利要求1所述的引物用于芝麻栽培種與Sesame?radiatum野生種遠(yuǎn)緣雜交后代的分子鑒定方法，其特征在于，具體步驟如下：

（1）挑選飽滿健康的芝麻栽培種（Sesame?indicum?L.,2n=26）與野生種（Sesame?radiatum,2n=64）種子，6月播種后于7月下旬植株進(jìn)入花期，進(jìn)行人工授粉雜交，采用組織培養(yǎng)方法對(duì)雜交后代幼胚進(jìn)行培養(yǎng)，獲得遠(yuǎn)緣雜交F₁后代；

（2）提取步驟（1）中芝麻栽培種（Sesame?indicum?L.,2n=26）、野生種（Sesame?radiatum,2n=64）及雜交后代F₁基因組DNA，作為模板備用；

（3）將步驟（2）提取的DNA模板應(yīng)用于PCR反應(yīng)體系，運(yùn)行PCR擴(kuò)增程序，在引物對(duì)HS209的引導(dǎo)下，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

（4）將步驟（3）的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果有栽培種特異性條帶210bp和野生種特異性條帶200bp、230bp的為真雜種；其余則為假雜種。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的基因組DNA的提取方法：取植株葉片，加入預(yù)冷的提取緩沖液，研磨，4℃離心，棄上清，于沉淀中加入預(yù)熱的裂解緩沖液，65℃水浴，加入氯仿/異戊醇混合液，混勻，15℃離心，取上清，加預(yù)冷的異丙醇，混勻，靜置，離心，棄上清，于沉淀中加入乙醇洗滌，離心，倒掉上清后干燥，加TE緩沖液，4℃溶解DNA30min以上，于20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的提取緩沖液包括：0.35MGlucose，0.1M?Tris-HCl，5mM?Na-EDTA，2%PVP，1%(V/V)β-Me，余量為無菌超純水。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的裂解緩沖液包括：1.4MNaCl，0.1M?Tris-HCl，20mM?Na-EDTA，2%CTAB，2%PVP，1%(V/V)β-Me，余量為無菌超純水。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的TE緩沖液包括：10mMTris-HCl(PH?8.0)，1mM?EDTA(PH?8.0)，余量為無菌超純水。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)體系為：DNA模版50ng，10×Buffer?1μL，10mmol·L^-1dNTPs?0.2μL，10μg·L^-1引物對(duì)HS2091μL，2.5U·μL^-1Taq?DNApolymerase?0.5μL，加入無菌超純水至終體積10μL。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性3min，94℃變性l?min，58℃退火45s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)，72℃總延伸10min；4℃保存。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子鑒定方法，其特征在于，凝膠電泳檢測(cè)為：聚丙烯酰胺凝膠濃度為10%，電泳緩沖液為1×TBE，150V恒壓電泳2小時(shí)，電泳結(jié)束后，凝固定先膠，再銀染，漂洗，顯色，漂洗凝膠后記錄讀取數(shù)據(jù)。