[發(fā)明專利]一種以豬瘟病毒重組蛋白NS2建立的ELISA試劑盒

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210311273.9
• 申請(qǐng)日: 2012-08-28
• 公開（公告）號(hào): CN102841209A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳紅云;范金紅;徐進(jìn)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 鄭州后羿制藥有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/543
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種以豬瘟病毒重組蛋白NS2建立的ELISA試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

豬瘟(Classical?swine?fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical?swine?fever?virus,CSFV)引起的豬的一種高度接觸性、致死性傳染病，臨床上主要以稽留高熱、皮膚和黏膜出現(xiàn)大量出血點(diǎn)為主要特征。CSF具有高度傳染性，主要通過呼吸道和消化道傳染，不分季節(jié)，傳播速度快，發(fā)病率和死亡率高，流行廣泛，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的最重要的疫病之一。我國將其列為一類傳染病，因此，加強(qiáng)CSFV診斷技術(shù)的研究對(duì)預(yù)防和控制本病具有重要的意義。

豬瘟的主要檢測技術(shù)有正向間接血凝試驗(yàn)(IHA)。用已知血凝抗原檢測未知血清抗體的試驗(yàn)，稱為正向間接血凝試驗(yàn)。抗原與其對(duì)應(yīng)的抗體相遇，在一定條件下會(huì)形成抗原復(fù)合物，但這種復(fù)合物的分子團(tuán)很小，肉眼看不見。若將抗原吸附（致敏）在經(jīng)過特殊處理的紅細(xì)胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗體的反應(yīng)靈敏性。經(jīng)過豬瘟抗原致敏的紅細(xì)胞與豬瘟抗體相遇，紅細(xì)胞便出現(xiàn)清晰可見的凝集現(xiàn)象。血凝抑制試驗(yàn)方法簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、敏感性強(qiáng)、特異性高，可應(yīng)用于豬瘟的檢驗(yàn)以及流行病學(xué)的調(diào)查等。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是當(dāng)前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的一項(xiàng)新技術(shù)。

NS2是一個(gè)具有自我裁剪功能的蛋白酶，可將前體蛋白NS2-3切割成NS2和NS3，其中His1447和Cys1512是保持NS2蛋白酶活性所必需的氨基酸殘基。NS2對(duì)病毒RNA復(fù)制是非必需的，但它可以調(diào)節(jié)病毒RNA復(fù)制，防止病毒RNA或蛋白在細(xì)胞內(nèi)聚集過多而導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡。所以，利用NS2非結(jié)構(gòu)蛋白包被抗原來檢測豬瘟兔化弱毒疫苗的是目前檢測的研究方向。近年來，國內(nèi)外對(duì)豬瘟的研究多數(shù)集中在以豬瘟的結(jié)構(gòu)蛋白E1和E2為基礎(chǔ)的診斷方法的研發(fā)方面，而對(duì)豬瘟病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS2為基礎(chǔ)的診斷方法研究較少。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種以豬瘟病毒重組蛋白NS2建立的ELISA試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種以豬瘟病毒重組蛋白NS2建立的ELISA試劑盒，包括豬瘟病毒重組蛋白NS2包被的酶標(biāo)板、10倍濃縮洗滌劑、血清稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)血清、抗豬IgG酶標(biāo)抗體、酶標(biāo)抗體稀釋液、封閉劑、顯色劑A、顯色劑B和終止液。

所述的濃縮洗滌劑為PBST，其含0.05%Tween-20的PBS溶液。

所述的血清稀釋液為1%BSA的PBS溶液。

所述的標(biāo)準(zhǔn)血清為標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清，其中，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清為用豬瘟兔化弱毒疫苗C株免疫后得到完全保護(hù)的豬血清，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清為從未用過疫苗且抗體水平接近陰性血清平均值的豬血清。

所述的酶標(biāo)抗體稀釋液為PBS緩沖液。

所述的封閉劑為5%BSA的PBS溶液。

所述的顯色劑A為含有1mg/ml?OPD，pH5.5的檸檬酸緩沖液。

所述的顯色劑B為H₂O₂。

所述的終止液為2M的H₂SO₄。

試劑盒將檢測血清樣品進(jìn)行預(yù)處理后，與包被好的抗原相結(jié)合，利用酶標(biāo)記的抗體與待檢血清樣品中的抗原或抗體特異性結(jié)合后，在底物溶液參與下顯色進(jìn)行檢測。

本發(fā)明的以豬瘟病毒重組蛋白NS2建立的ELISA試劑盒的制備方法包括以下步驟：

（1）包被抗原的制備：參照豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因組序列，設(shè)計(jì)并合成一組引物為：

引物15’TGCCTCGTAGTTATGTAAACAGGCAGCCA3’

引物25’TTTGGATTCCCTCCATCCTTAGTGGAGTTGCC3’；

通過用逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增出NS2長1371bp的片段，將擴(kuò)增的NS2基因序列克隆至表達(dá)載PEGFP-C1中，構(gòu)建成重組真核表達(dá)載體PEGFPNS2，經(jīng)酶切鑒定后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，于37℃，0.5mmol/L?IPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)親和層析純化獲得純化的重組蛋白NS2；

（2）以純化后的豬瘟病毒重組蛋白NS2作抗原建立ELISA試劑盒；