[發(fā)明專利]一種腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗成品各群多糖含量的測定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210304908.2
• 申請日: 2012-08-26
• 公開（公告）號: CN102809655A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃鎮(zhèn);吳凱;樊會(huì)蘭;張勝祥;馬波;周燕美;李如彪;包南艷;楊志偉;周進(jìn)寶;劉國秀;錢紅兵
• 申請（專利權(quán)）人: 玉溪沃森生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/561
• 代理公司: 昆明合眾智信知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 53113
• 代理人: 康珉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗成品各群多糖含量的測定方法。

背景技術(shù)

腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗成品多糖（抗原）含量是確保疫苗有效性的基本條件之一。對于單獨(dú)結(jié)合物原液多糖含量，A群可通過測定磷含量獲得，C、Y、或W135群可通過測定唾液酸含量獲得，而4個(gè)群以上的腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗成品，如A、C、Y、W135群結(jié)合疫苗成品中A、C、Y、W135群結(jié)合物混合在一起，且C、Y、W135群均含有唾液酸，故無法通過測唾液酸含量獲得C、Y、W135各群多糖含量。

《火箭免疫電泳法定量檢測4價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗中C群腦膜炎球菌多糖含量的方法學(xué)驗(yàn)證》（林云等，發(fā)表于在國際生物制品學(xué)雜志2008年12月第31卷第6期）中介紹了一種檢測4價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗中C群腦膜炎球菌多糖含量的方法，解決了測定A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖疫苗成品各群多糖含量的技術(shù)問題，但該方法不適用于測定結(jié)合疫苗成品中各群多糖含量，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)證明，結(jié)合疫苗中各群結(jié)合物的載體蛋白會(huì)對火箭免疫電泳產(chǎn)生影響，導(dǎo)致結(jié)果不能真實(shí)準(zhǔn)確地反映多糖含量，故測定3個(gè)群以上的多糖結(jié)合疫苗成品包括A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗成品各群多糖含量是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)，目前尚無該多糖結(jié)合疫苗成品各群多糖含量測定方法的相關(guān)報(bào)道，需建立一種方法準(zhǔn)確測定該多糖結(jié)合疫苗成品中A、C、Y、W135等各群的多糖含量。

抗原抗體反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。?這種反應(yīng)即可在機(jī)體內(nèi)進(jìn)行，也可以在機(jī)體外進(jìn)行。抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)主要有三性：即特異性、比例性、可逆性。?特異性，是抗原抗體反應(yīng)的最主要特征，這種特異性是由抗原決定簇和抗體分子的超變區(qū)之間空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性確定的。這種高度的特異性在傳染病的診斷與防治方面得到有效的應(yīng)用。隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，還將在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域得到更加深入和廣泛的應(yīng)用，比如腫瘤的診斷和特異性治療等。比例性，是指抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系，只有當(dāng)二者濃度比例適當(dāng)時(shí)才出現(xiàn)可見反應(yīng)，在抗原抗體比例相當(dāng)或抗原過剩或抗體過剩的情況下，反應(yīng)最徹底，形成的免疫復(fù)合物沉淀最多、最大。而當(dāng)抗原抗體比例超過此范圍時(shí)，反應(yīng)速度和沉淀物量都會(huì)迅速降低甚至不出現(xiàn)抗原抗體反應(yīng)。可逆性，是指抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離恢復(fù)為抗原與抗體的特性。由于抗原抗體反應(yīng)是分子表面的非共價(jià)鍵結(jié)合，所形成的復(fù)合物并不牢固，可以隨時(shí)解離，解離后的抗原抗體仍保持原來的理化特征和生物學(xué)活性。

火箭免疫電泳技術(shù)又稱作單向電泳擴(kuò)散免疫沉淀試驗(yàn)，它是由單向擴(kuò)散發(fā)展起來的一項(xiàng)定量技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是加速度地單向擴(kuò)散。在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測標(biāo)本后，將抗原置陰極端，用橫距2—3mA／cm的電流強(qiáng)度進(jìn)行電泳。抗原泳向陽極，在抗原抗體比例恰當(dāng)處發(fā)生結(jié)合沉淀。隨著泳動(dòng)抗原的減少，沉淀逐漸減少，形成峰狀的沉淀區(qū)，狀似火箭。抗體濃度保持不變，峰的高度與抗原量成正比，用已知量標(biāo)準(zhǔn)抗原作對照，可以方便地測定未知標(biāo)本中的抗原含量。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)還沒有能對3個(gè)群以上多糖結(jié)合疫苗成品中各群的多糖含量進(jìn)行測定的方法，導(dǎo)致該多糖結(jié)合疫苗成品質(zhì)量難以控制，其目的是提供一種可以準(zhǔn)確、快速測定腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗成品各群多糖含量的方法。

為解決上述技術(shù)問題和達(dá)到本發(fā)明目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

本發(fā)明所述的一種腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗成品各群多糖含量的測定方法，包括以下步驟：

（1）檢品供試品的制備

①預(yù)處理：取待檢測的4個(gè)群以上的腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗成品用注射用水按標(biāo)示量復(fù)溶后，取5.0ml于超濾杯中，5000～10000×g離心超濾20～40min，收集濃縮液，補(bǔ)注射用水至總體積為1.0ml，得超濾濃縮液；用Lowry法測定該超濾濃縮液中蛋白的濃度；

②蛋白酶K處理：酶解反應(yīng)體系總體積為420μl，以所述的酶解反應(yīng)體系總體積為基準(zhǔn)，取1/6體積的超濾濃縮液，加入1/10體積的蛋白酶K緩沖液、蛋白酶K，蛋白酶K的量為酶解反應(yīng)體系中蛋白含量的2～8倍，并補(bǔ)加注射用水至420μl，混勻后于37℃孵育6小時(shí)±2小時(shí)，即得檢品供試品；

（2）抗血清瓊脂糖膠板的制備