[發(fā)明專(zhuān)利]荷葉中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物及用途

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210304834.2
• 申請(qǐng)日: 2012-08-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102827221A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程翼宇;王毅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07H17/07
• 分類(lèi)號(hào): C07H17/07;C07H1/08;C07D311/30;C07D311/40;C12Q1/34;A61P3/10
• 代理公司: 杭州求是專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于藥物篩選方法領(lǐng)域，涉及一種荷葉中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，尤其涉及應(yīng)用磁珠分離和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用定性從荷葉中篩選得到具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，并在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

糖尿病是一種慢性代謝紊亂性疾病，其主要的干預(yù)方法是控制飲食、減少攝入性碳水化合物的含量、藥物治療等。人體攝入的碳水化合物經(jīng)過(guò)小腸上皮細(xì)胞的酶（如淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）的水解作用生成葡萄糖之后，才被吸收進(jìn)入血液循環(huán)。阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制劑可以抑制α-葡萄糖苷酶，減少碳水化合物轉(zhuǎn)化成葡萄糖，是一類(lèi)臨床常用的糖尿病治療藥物。現(xiàn)有的α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選方法主要采用體外酶活性抑制實(shí)驗(yàn)，僅能對(duì)純化合物的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，難以用于中藥等復(fù)雜混合物中α-葡萄糖苷酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)。

親和選擇技術(shù)聯(lián)用質(zhì)譜分析方法可以快速分析與鑒定與特定蛋白或酶結(jié)合的配體化合物，如將特定蛋白或酶加入待篩選的樣品中使用超濾膜把蛋白結(jié)合物與未結(jié)合的化合物分離開(kāi)，再進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)；或是把特定蛋白或酶固定在色譜固定相中，使用洗脫溶劑把化合物按照與蛋白的結(jié)合強(qiáng)弱依次洗脫下來(lái)，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)；還可將特定蛋白或酶固定在某種合適的載體上，與配體化合物作用后，把不結(jié)合的化合物洗脫掉，然后把與酶結(jié)合的化合物洗脫出來(lái)，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供荷葉中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，是利用磁珠分離聯(lián)用液質(zhì)定性的快速篩選方法獲得，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：????????????????????????????????????????????????將空白羧基磁珠用1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液和N-羥基琥珀酰亞胺溶液活化；在活化磁珠中，加入α-葡萄糖苷酶溶液及2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液，振蕩孵育一段時(shí)間后使α-葡萄糖苷酶鍵合于空白羧基磁珠上；對(duì)酶鍵合磁珠進(jìn)行電鏡分析、磁力測(cè)試和紅外分析考察鍵合磁珠質(zhì)量；在酶鍵合磁珠中加入荷葉提取物水溶液，振蕩孵育一段時(shí)間后，移去孵育液，將α-葡萄糖苷酶鍵合磁珠洗脫液進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用定性分析，篩選獲得具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物；分離制備化合物并進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性驗(yàn)證。

具體的步驟如下：

1.?制備鍵合α-葡萄糖苷酶的磁珠

（1）磁珠活化：取磁珠使用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液和N-羥基琥珀酰亞胺溶液混合均勻，孵育活化30min后移去上清液，并用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液清洗；

（2）磁珠鍵合：在活化的磁珠上，加入含α-葡萄糖苷酶的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液，震蕩混合均勻，在室溫孵育30min進(jìn)行包被，移去上清液，再用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗包被的磁珠4次，棄去清洗液，待用。

（3）鍵合磁珠質(zhì)量考察??將制備的鍵合磁珠分散在PBS溶液中，使用掃描式電子顯微鏡對(duì)空白磁珠、α-葡萄糖苷酶鍵合磁珠的表面分別分析，檢查酶鍵合情況。采用傅里葉變換紅外光譜儀，測(cè)定空白磁珠、α-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶鍵合磁珠的紅外光譜，檢查酶結(jié)合情況。采用磁強(qiáng)計(jì)數(shù)儀考察鍵合磁珠的磁力變化情況。

2.?篩選具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物

（1）具潛在α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物初篩：取100?μl荷葉提取物水溶液2份，分別加到1ml?分散于醋酸銨溶液的鍵合α-葡萄糖苷酶的磁珠和空白磁珠，放在振蕩器上混勻，孵育1?h。棄去上清液，再加入1ml醋酸銨溶液清洗2次，棄去清洗液，最后使用含10%乙腈的醋酸銨溶液洗脫，吸取洗脫液備用，平行操作三份，取空白磁珠和酶鍵合磁珠的洗脫液進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

（2）目標(biāo)化合物獲取及活性驗(yàn)證

采用常規(guī)柱色譜分離技術(shù)分離獲取目標(biāo)化合物群，再采用制備液相色譜分離、純化目標(biāo)化合物或購(gòu)置目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品

采用酶抑制活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證純化的目標(biāo)化合物是否具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，計(jì)算其半數(shù)抑制濃度。

本發(fā)明提供的荷葉中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的結(jié)構(gòu)通式如下：