[發明專利]桑葉中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物及用途

無效

• 申請號: 201210304832.3
• 申請日: 2012-08-25
• 公開（公告）號: CN102816832A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 程翼宇;王毅
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34;C07H17/07;A61K31/7048;A61P3/10
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明屬于藥物篩選方法領域，涉及桑葉中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，尤其涉及應用磁珠分離和液相色譜-質譜聯用及核磁共振分析技術從桑葉中獲得具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，并在制備治療糖尿病藥物中的應用。

背景技術

糖尿病是一種慢性代謝紊亂性疾病，其主要的干預方法是控制飲食、減少攝入性碳水化合物的含量、藥物治療等。人體攝入的碳水化合物經過小腸上皮細胞的酶（如淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）的水解作用生成葡萄糖之后，才被吸收進入血液循環。阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制劑可以抑制α-葡萄糖苷酶，減少碳水化合物轉化成葡萄糖，是一類臨床常用的糖尿病治療藥物?，F有的α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選方法主要采用體外酶活性抑制實驗，僅能對純化合物的活性進行評價，難以用于中藥等復雜混合物中α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選。

親和選擇技術聯用質譜分析方法可以快速分析與鑒定與特定蛋白或酶結合的配體化合物，如將特定蛋白或酶加入待篩選的樣品中使用超濾膜把蛋白結合物與未結合的化合物分離開，再進行質譜檢測；或是把特定蛋白或酶固定在色譜固定相中，使用洗脫溶劑把化合物按照與蛋白的結合強弱依次洗脫下來，進行質譜檢測；還可將特定蛋白或酶固定在某種合適的載體上，與配體化合物作用后，把不結合的部分洗脫掉，然后把結合配體洗脫出來，進行質譜檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種桑葉中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，該化合物通過以下步驟實現：?

（1）制備鍵合α-葡萄糖苷酶的磁珠

（a）磁珠活化：取磁珠使用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液和N-羥基琥珀酰亞胺溶液混合均勻，孵育活化30?min后移去上清液，并用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液清洗；

（b）磁珠鍵合：在活化的磁珠上，加入含α-葡萄糖苷酶的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液，震蕩混合均勻，在室溫孵育30?min進行包被，移去上清液，再用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗包被的磁珠4次，棄去清洗液，待用。

（2）鍵合磁珠質量考察：將制備的鍵合磁珠分散在PBS溶液中，使用掃描式電子顯微鏡對α-葡萄糖苷酶鍵合磁珠的表面分別進行掃描成像，檢查磁珠鍵合情況，磁珠表面不粗糙、較光滑的表明鍵合情況良好。

（3）篩選具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物

（a）具潛在α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物初篩：取30μl桑葉提取物水溶液2份，分別加到1ml?分散于醋酸銨溶液的鍵合α-葡萄糖苷酶的磁珠和空白磁珠，放在振蕩器上混勻，孵育1?h。棄去上清液，再加入1ml醋酸銨溶液清洗2次，棄去清洗液，最后使用含10%乙腈的醋酸銨溶液洗脫，吸取洗脫液備用，平行操作三份，取空白磁珠和酶鍵合磁珠的洗脫液進行液相分析及液質鑒定，洗脫液濃縮后，用氘代二甲基亞砜（DMSO）溶解，做核磁共振氫譜分析；

（b）目標化合物獲取及活性驗證

采用常規柱色譜分離技術分離獲取目標化合物群，再采用制備液相色譜分離、純化目標化合物或購置相對應的目標化合物；

采用酶抑制活性實驗驗證純化的目標化合物是否具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，計算其半數抑制濃度。

所述化合物為異槲皮素和紫云英苷。

本發明的另一個目的是提供從桑葉中篩選獲得的具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物在制備抗糖尿病藥物中的應用。

本發明通過一種快速篩選桑葉中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的方法，提供一種具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物。與傳統方法相比，初篩無須制備分離化合物，顯著提高了篩選效率、縮短了篩選時間，減少了標的化合物制備分離步驟。此外，本篩選方法具有快速、準確、重現性好等特點。可推廣用于天然藥物或中藥混合物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的快速篩選。本發明方法獲得的具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物可在制備抗糖尿病藥物中應用。?

附圖說明

圖?1?磁珠電鏡圖，A：空白磁珠，B：α-葡萄糖苷酶鍵合磁珠。

圖?2桑葉磁珠結合洗脫液液相色譜圖。

圖?3桑葉磁珠結合洗脫液液相色譜-質譜圖，其中圖3-1和圖3-2分別為峰8的光譜圖與質譜圖，圖3-3和圖3-4分別為峰10的光譜圖與質譜圖。

圖4?桑葉磁珠結合洗脫液核磁共振氫譜圖。

具體實施方式

下面將結合附圖和實施例進一步說明本發明的實質內容及有益效果，該實施例僅用于說明本發明而非對本發明的限制。