[發明專利]一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯免疫檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201210304592.7
• 申請日: 2012-08-24
• 公開（公告）號: CN102854309A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 李平;肖震;周成林;周洪斌;吳小華
• 申請（專利權）人: 鎮江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心
• 主分類號: G01N33/545
• 分類號: G01N33/545
• 代理公司: 上海瀚橋專利代理事務所(普通合伙) 31261
• 代理人: 胡思棉

1.一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于含有以下組分：

（1）、吡喹酮標準溶液：

（2）、辣根過物氧化酶標記羊抗兔抗體溶液；

（3）、吡喹酮抗血清；

（4）、濃縮洗滌液；

（5）、顯色液；

（6）、終止液；

（7）、已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的聚苯乙烯微量反應板；

（8）、空白聚苯乙烯微量反應板。

2.如權利要求1所述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的吡喹酮抗血清通過如下方法制備，其制備過程具體包括如下步?驟：?

①、10mg吡喹酮加入0.15ml?1N?HCl中，油浴升溫至120℃回流反應3h，反應結束后，冷卻放置，待底部油狀物固化后，倒出上層水層，用NaHCO₃調節pH至9.0，二氯甲烷40ml*3萃取該水相,無水硫酸鈉干燥，旋轉蒸發得到產物；

②、將4-氨基環己烷羧酸10mg,和NaCO₃12mg,溶解到75ml蒸餾水中，然后滴加芐氧基羰酰氯16mg，在室溫下劇烈攪拌3h至產生沉淀，以3號砂芯漏斗過濾分離出的沉淀，以乙醚洗滌3次，然后溶入100?ml1?N?HCl中，先以0.15ml乙醚提取1次，再用100ml、100ml乙醚提取2次，合并提取物以1NHCl?50ml、50ml、50ml洗3次，過無水NaSO₄柱脫水，50℃真空濃縮至干得白色粉末；

③、取步驟①所得的產物0.5mg與步驟②所得的白色粉末0.72mg用30ml二氯甲烷溶解，再加入0.76mg環已基碳二亞胺，0.39mg4-（N,N-二甲基氨基）吡啶,常溫反應過夜，反應結束后生成白色固體，抽濾，所得的濾液用10ml1N?HCl洗滌，再旋轉蒸發得黃色固體，用甲醇：二氯甲烷為1：10的展開劑進行薄層板分離純化；

④、將步驟③所得的黃色固體經薄層分離純化后的產物0.5mg，鈀碳0.2mg，置于圓底燒瓶中，抽真空，充氫氣;加入15ml甲醇,常溫反應2-3h，過濾去除鈀碳，以甲醇：二氯甲烷為1：10的展開劑進行薄層板分離純化得到吡喹酮氨；

⑤、免疫原的制備

稱取0.01mg?BSA溶于1ml，濃度為100mM，pH?7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，再加入0.01mg丁二酸酐，常溫反應3h；

上述常溫反應3h后的產物分別用500ml*3，濃度為100mM，pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液透析3天，每4h更換緩沖液；

在上述透析后的產物中加入0.004mg碳二亞胺鹽酸鹽和0.004mgN-羥基琥珀酰亞胺,再加入步驟④所得的吡喹酮胺0.008mg，4℃反應3h；

上述4℃反應3h后的產物用含8mg氯化鈉的1000ml*3，濃度為10mM，pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液透析3天，透析好的產物即為免疫原即吡喹酮胺-BSA；

⑥、吡喹酮抗血清制備

選用臨床健康，體重1.5—2Kg的新西蘭雄性兔4只，第一次免疫用1mL弗氏完全佐劑加1ml步驟⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA皮下或皮內多點注射，此后每間隔四周用1ml弗氏不完全佐劑加1mL步驟⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA，前后共免疫5次，最后一次免疫后10天宰殺，采血，分離出血清即得吡喹酮抗血清。

3.如權利要求2所述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的吡喹酮標準溶液的濃度分別為250，125，31.3，20，7.8，0ng/ml。

4.如權利要求3所述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯免疫檢測試劑盒，

其特征在于所述的濃縮洗滌液為0.2M/L磷酸鹽-吐溫20緩沖液。

5.如權利要求4所述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的顯色液為3，3，5，5四甲基聯苯胺—H₂O₂溶液。

6.如權利要求5所述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的終止液為2mol/LH₂SO₄溶液。