[發明專利]一種檢測CHO培養細胞中支原體污染的試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201210303846.3
• 申請日: 2012-08-24
• 公開（公告）號: CN103627781A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 劉曉志;周興軍;董向峰;常亮;陳雪靜;劉素霞;趙偉;高健;段寶玲
• 申請（專利權）人: 華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/35
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測CHO培養細胞中支原體污染的試劑盒，它包括置于同一PCR體系中的特異性擴增CHO細胞甘油醛-3-磷酸脫氫酶DNA序列的引物對與特異性擴增支原體16s?rRNA保守區域DNA序列的引物對。

2.如權利要求1所述的試劑盒，所述特異性擴增CHO細胞甘油醛-3-磷酸脫氫酶DNA序列的引物對為：

上游引物GF：5’-?CAAAGGCACAGTCAAGGCTGA?-3’；

下游引物GR：5’-?TGGTGAAGACGCCAGTAGATT?-3’。

3.如權利要求1所述的試劑盒，所述特異性擴增支原體16srRNA保守區域DNA序列的引物對為：

上游引物MF：5’-?ACACCATGGGAGCTGGTAAT?-3’；

下游引物MR：5’-?GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT?-3’。

4.如權利要求3所述的試劑盒，所述特異性擴增支原體16s?rRNA保守區域DNA序列的引物對的擴增產物長度為400～500?bp。

5.如權利要求1所述的的試劑盒，所述PCR體系中特異性擴增CHO細胞甘油醛-3-磷酸脫氫酶DNA序列的引物對與特異性擴增支原體16s?rRNA保守區域DNA序列的引物對的濃度比為1:2。

6.如權利要求1所述的試劑盒，所述PCR體系中含有PCR反應緩沖液、dNTPs溶液、?rTaq聚合酶和超純水。

7.利用權利要求1～6任一項所述試劑盒檢測CHO培養細胞中支原體污染的方法，包括如下步驟:

1)提取待檢CHO培養細胞的DNA；

2)以步驟1)中提取的DNA為模板加入PCR體系，進行擴增反應；??

3)以去核酸水為模板加入PCR體系，進行擴增反應，作為陰性對照;

4)所有擴增反應結束后，同時進行瓊脂糖凝膠電泳；

5)觀察瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，判定檢測結果的方法如下所述：

A)當特異性擴增CHO細胞甘油醛-3-磷酸脫氫酶DNA序列的引物對相應的擴增產物出現，陰性對照沒有出現擴增產物時，說明PCR體系正常工作，此時的PCR檢測結果準確可靠；

A-Ⅰ)此時，如果沒有出現特異性擴增支原體16s?rRNA保守區域DNA序列的引物對相應的擴增產物，說明CHO培養細胞中沒有出現支原體污染；

A-Ⅱ)此時，如果出現了特異性擴增支原體16s?rRNA保守區域DNA序列的引物對相應的擴增產物，說明CHO培養細胞中出現了支原體污染；

B)如果特異性擴增CHO細胞甘油醛-3-磷酸脫氫酶DNA序列的引物對相應的擴增產物沒有出現，說明PCR體系沒有正常工作，此時檢測結果無效；

C)如果陰性對照出現擴增產物，說明PCR體系受到污染，此時檢測結果無效。

8.如權利要求7所述的檢測方法，步驟1)中所述提取待檢CHO培養細胞DNA的方法為：取待檢CHO培養細胞液離心沉淀；用PBS緩沖液充分懸浮沉淀物，離心沉淀；棄上清，加入TE緩沖液，再次充分懸浮沉淀物，煮沸；離心沉淀，取上清作為PCR反應模板。

9.如權利要求7所述的檢測方法，步驟2)與步驟3)所述擴增反應的反應條件為：94℃?預變性?5分鐘，然后?94℃?變性30秒，50℃～53?℃?退火?30秒，72?℃?延伸?40?秒，35個循環后，72?℃恒溫?10分鐘。