[發(fā)明專利]用于乙型肝炎病毒四色熒光定量PCR檢測(cè)的試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210290468.X
• 申請(qǐng)日: 2012-08-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103088151A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳智;符芳芳;朱海紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

技術(shù)領(lǐng)域

發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種乙型肝炎病毒核酸定量、分型和YMDD耐藥突變四色熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用方法。

背景技術(shù)

乙型肝炎病毒（Hepatitis?B?virus，HBV）在全世界范圍內(nèi)的感染患者超過(guò)3億5千萬(wàn)，是誘發(fā)慢性乙肝和肝癌的主要原因。我國(guó)更是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，HBV感染率高達(dá)57.63%，其中，大約80％肝癌由乙肝引起，嚴(yán)重威脅著我國(guó)公眾的生命健康，所以對(duì)肝炎的診斷產(chǎn)品的研究具有重要的社會(huì)意義。

對(duì)人血清樣本中HBV?總DNA的定量檢測(cè)，可用于乙型肝炎的臨床輔助診斷，確定是否有HBV感染以及病毒載量；并可通過(guò)監(jiān)測(cè)患者血清HBV?DNA水平的變化，對(duì)抗病毒藥物的療效進(jìn)行輔助觀察和判斷。

HBV根據(jù)基因組序列可分為A-H共8種基因型，其中中國(guó)較常見(jiàn)的是B型和C型。?在長(zhǎng)江以南地區(qū)，以基因型B型為主，占55%，長(zhǎng)江以北C型為主，占81.6%。由于Orito等發(fā)現(xiàn)HBV?基本核心啟動(dòng)子（BCP）雙突變?cè)贑型中明顯比B型多見(jiàn)，也有研究認(rèn)為C型HBV患者中DNA陽(yáng)性率明顯高于B型，且C型病毒感染者病毒低度也高于B型，B型感染者早與C型感染者10年發(fā)生HBeAg血清轉(zhuǎn)陰，故C型感染者長(zhǎng)期高水平的HBV?DNA易導(dǎo)致病情加重。因此選取基因型C型為本試劑盒分型鑒定的指標(biāo)，從而為治療和預(yù)后提供幫助。

目前治療乙型肝炎最常用的核苷類抗病毒藥物包括拉米夫定、阿德福韋等，慢性乙肝患者長(zhǎng)時(shí)間服用后容易發(fā)生病毒基因組特定位點(diǎn)變異，從而引發(fā)耐藥。根據(jù)統(tǒng)計(jì)變異出現(xiàn)的概率大約為30%以上，大量樣本的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，常見(jiàn)的拉米夫定耐藥突變位點(diǎn)如表1所示。最主要的耐藥突變位點(diǎn)是M204，雖然也有173和180、181位點(diǎn)突變，但是這三個(gè)位點(diǎn)突變的拉米夫定耐藥樣本，基本上都同時(shí)聯(lián)合有204位點(diǎn)的變異，因此，204位點(diǎn)是最主要的拉米夫定耐藥突變監(jiān)測(cè)位點(diǎn)。一旦檢測(cè)到病毒變異，需要及時(shí)調(diào)整治療策略。

表1

發(fā)明內(nèi)容?

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種能同時(shí)檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA總量、C型基因型和YMDD位點(diǎn)耐藥突變（YVDD/YIDD）的四色熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用方法，在單管反應(yīng)中同時(shí)對(duì)HBV?DNA進(jìn)行定量、鑒別HBV?C型基因型、以及監(jiān)測(cè)204位點(diǎn)YVDD和YIDD兩種耐藥突變發(fā)生情況。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種用于乙型肝炎病毒核酸定量、分型和YMDD耐藥突變四色熒光定量PCR檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒含有兩種引物及四種探針，各引物或探針的名稱、DNA序列和熒光標(biāo)記表2所示：

表2

所述各引物、探針與buffer、MgCl₂、含dUTP的?dNTPs裝于一個(gè)容器內(nèi)構(gòu)成PCR檢測(cè)混合液mix；該試劑盒還包括Taq酶、UDG酶，陰性對(duì)照樣品和陽(yáng)性對(duì)照樣品(陰性對(duì)照為確認(rèn)HBV?DNA陰性血清；陽(yáng)性對(duì)照為含1.0E+06?IU/ml?HBV?DNA目的基因片段的血清樣本)；

在利用所述引物及探針建立的25μL?PCR反應(yīng)體系中，各組分的終濃度為：10倍反應(yīng)緩沖液buffer，1×；MgCl₂，4.5mM；dNTPs，各0.2mM；dUTP，0.2mM；Taq酶，2.5U（U表示酶的活力單位）；UDG酶，0.1U；各條引物，各0.1μM；各條探針，各0.25μM；待測(cè)樣品模板DNA（經(jīng)核酸抽提方法處理過(guò)的待測(cè)血清或血漿樣本，陽(yáng)性樣本中即含待測(cè)的HBV?DNA）；5μL。

該試劑盒為32人份；試劑盒中的dNTPs中含有dUTP，和試劑盒中UDG酶共同構(gòu)成防污染體系，防止PCR產(chǎn)物污染造成的假陽(yáng)性結(jié)果。

應(yīng)用上述試劑盒檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA總量、C型基因型和YMDD位點(diǎn)耐藥突變（YVDD/YIDD）的方法，其過(guò)程包括利用所述引物、探針建立PCR反應(yīng)體系，用煮沸法從待測(cè)標(biāo)本中提取DNA，加入前述反應(yīng)體系中，在熒光定量PCR儀上設(shè)定反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熒光型號(hào)檢測(cè)；具體包括：

(1)利用所述引物、探針建立的25μL?PCR反應(yīng)體系如表3所示?

表3