[發明專利]用于乙型肝炎病毒四色熒光定量PCR檢測的試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201210290468.X
• 申請日: 2012-08-15
• 公開（公告）號: CN103088151A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 陳智;符芳芳;朱海紅
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

1.用于乙型肝炎病毒四色熒光定量PCR檢測的試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有兩種引物及四種探針，各引物或探針的名稱、DNA序列和熒光標記分別為：

上游引物：5’-GCACTTGTATTCCCATCCCATCAT-3’；nt645-662,?18bp；

下游引物：5’-AGCAAAGCCCAAAAGACCCACAAT-3’；nt982-1005,?24bp,?antisense；

定量探針5’-ROX-TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTT-BHQ2-3’；nt768-791,?24bp；

C型探針5’-CY5-TRAACCCTAATAAAACCAAACGTTGG-BHQ2-3’；nt836-861,?26bp；

YVDD探針5’-VIC-?CATCATCCACATARC-MGB-3’；nt751-765,?15bp,?antisense；

YIDD探針5’-NED-CCACATCATCAATATA-MGB-3’；nt754-769,?16bp,?antisense。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述各引物、探針與buffer、MgCl₂、含dUTP的?dNTPs裝于一個容器內構成PCR檢測混合液mix；該試劑盒還包括Taq酶、UDG酶、陰性對照樣品和陽性對照樣品，其中陰性對照為確認HBV?DNA陰性血清，陽性對照為含1.0E+06?IU/ml?HBV?DNA目的基因片段的陽性樣本；

在利用所述引物及探針建立的25μL?PCR反應體系中，各組分的終濃度為：10倍反應緩沖液buffer，1×；MgCl₂，4.5mM；dNTPs，各0.2mM；dUTP，0.2mM；Taq酶，2.5U；UDG酶，0.1U；各條引物，各0.1μM；各條探針，各0.25μM；?待測樣品模板DNA,?5μL。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒為32人份。

4.一種應用權利要求1所述試劑盒檢測乙型肝炎病毒DNA總量、C型基因型和YMDD位點耐藥突變的方法，其特征在于，包括利用所述引物、探針建立PCR反應體系；用煮沸法從待測標本中提取DNA，加入前述PCR反應體系；在熒光定量PCR儀上設定反應條件，進行PCR擴增和熒光型號檢測；其中，

在利用所述引物及探針建立的25μL?PCR反應體系中，各組分的終濃度為：10倍反應緩沖液buffer，1×；MgCl₂，4.5mM；dNTPs，各0.2mM；dUTP，0.2mM；Taq酶，2.5U；UDG酶，0.1U；各條引物，各0.1μM；各條探針，各0.25μM；?待測樣品模板DNA；5μL；

所述PCR反應的條件為：37℃?2分鐘UDG酶作用，消化污染的PCR產物片段；95℃?2分鐘熱啟動并滅活UDG酶；然后進入40個PCR擴增循環，循環溫度控制為95℃?10秒，60攝氏度退火70秒。