[發明專利]人異基因有核細胞工業化制備自然殺傷性細胞（NK）及注射液

有效

• 申請號: 201210288669.6
• 申請日: 2012-08-15
• 公開（公告）號: CN102988415A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 王沁怡;王懷林
• 申請（專利權）人: 王沁怡;王懷林
• 主分類號: A61K35/14
• 分類號: A61K35/14;A61K35/44;A61K9/10;A61P37/04;A61P35/00;C12N5/0783
• 代理公司: 寧夏專利服務中心 64100
• 代理人: 葉學軍

技術領域

本發明涉及一種利用人臍帶血或外周血的有核細胞作為種子細胞，采用工業化大規模生產方式，制備自然殺傷性細胞(NK)的方法；特別是一種人異基因有核細胞工業化制備自然殺傷性細胞(NK)及注射液。?

技術背景

自然殺傷細胞(nature?killer?cell，NK?cell)是人體介導固有免疫細胞，其表面標記的主要代表是CD3^-、CD56⁺、CD16⁺、CD57⁺、CD8⁺，它的特點是含有穿孔素和顆粒酶，不用預先致敏就可以裂解對NK細胞敏感的腫瘤細胞，從而殺傷腫瘤細胞。自然殺傷細胞是介導抗體依賴的細胞毒作用的主要細胞，它表達腫瘤細胞壞死因子家族的幾個配體，可以導致多種腫瘤靶細胞凋亡。這種以腫瘤細胞凋亡方式殺傷腫瘤細胞的機制比分泌性的，顆粒介導的殺傷還被科學家看好，因為大多數腫瘤細胞的受體對凋亡導致的死亡敏感，所以自然殺傷細胞(NK)在抗腫瘤方面非常有意義。自然殺傷細胞的抗腫瘤作用是國際主流醫學不爭的事實。?

自然殺傷細胞(NK)能導致多種腫瘤細胞凋亡，是腫瘤免疫治療的一個途徑，國際醫學界的共識。而該自然殺傷細胞(NK)是人體內淋巴細胞中的一類，數量很少，僅占淋巴細胞總數的1-1.5％，所以，如何獲得自然殺傷細胞(NK)成了醫學界的熱點。?

科學家用病人自體外周血細胞加細胞誘導因子培養擴增2—6周，使得CD56?⁺和CD3⁺細胞增加5—10％不等，這一方法獲得的殺傷性淋巴細胞稱為細胞因子誘導殺傷性細胞CIK細胞Cytokine?induced?killer?cell)。也有科學家采取先獲得間充質干細胞(MSC)體外誘導培養自然殺傷細胞(NK)的；也有用造血干細胞誘導培養自然殺傷細胞(NK)的。這些誘導培養獲得自然殺傷細胞(NK)的方法都有一定局限性。對于晚期腫瘤者不是醫生認為該用細胞治療就用CIK細胞治療，往往是受到培養時間、培養條件的限制。自然殺傷性細胞的時間長于癌癥病人的病情發展時間，在臨床上受到一定的限制。?

自然殺傷性淋巴細胞是醫學界肯定的抗腫瘤細胞和抗免疫力的細胞治療方法。在臨床上都是用病人的外圍血分離出單個核細胞加上細胞誘導因子在體外培養擴增了2-6周，培養誘導的目的是讓單核細胞生長成T淋巴細胞(表面標志物?CD3⁺，CD56⁺)達到一定數量后回輸給患者。正常人體內CD3⁺、CD56⁺細胞數量很少，而用體外誘導培養的方法擴增2-6周，CD3⁺最低達到20％，CD56⁺最低達到5％以上，用于個性化治療在臨床取得了一定的療效，使五年存活率明顯升高。但是，在臨床治療的開展和推廣方面還有局限性。?

首先，由于這項技術是以單個核細胞為載體，加上細胞誘導因子，培養擴增為殺傷性淋巴細胞用于臨床治療的。目前為止全世界絕大多數都是采用一對一的個性化治療。即采集一份患者的單個核細胞或者是采集一份供體血液，分離出單個核細胞，在體外誘導擴增后用于患者治療各種實體腫瘤。這種傳統的治療方法首先是一對一的個體化治療方法，只能在醫院床邊開展。?

第二，這種治療方法自然殺傷性細胞制備的時間一般需要2—6周，對于晚期腫瘤病人，尤其是手術后放療、化療的病人來講，有的病人就等不到細胞制備完成，等不到細胞回輸的時候就與世長辭了。?

第三，由于一對一的治療，也就是每一個人要做一全套細胞誘導擴增培養的過程，從實驗室管理角度講，室內質量控制很難，室間質量控制更難。盡管是一個非常好的醫療技術，但很難推廣和普及。不是每個病人都享有平等的治療機會。?

第四、上述方法制備的CIK細胞從理論上講是由成體干細胞誘導、培養和擴增而來的，培養液中含有大量的成體干細胞，可以無限繁殖生產CIK細胞。在臨床上其擴增繁殖時間5-6周以后其繁殖速度明顯下降，繁殖的量(倍增數)也明顯不及早期。而且隨著繁殖代數的增加對腫瘤細胞的免疫殺傷作用也降低。所以控制和撐握自然殺傷性細胞(NK)的培養傳代的周期很重要，保持自然殺傷性細胞(NK)生物活性更重要。?

第五、傳統的方法采取腫瘤病人來源的單個核細胞或者造血干細胞為原代細胞，細胞因子誘導CIK細胞。這些來源腫瘤病人的單個核細胞，部分病人的單個核細胞與所患的腫瘤細胞有共同抗原性，所以用這些病人的單個核細胞作為原代細胞，誘導的CIK細胞的抗腫瘤能力往往較差。?