[發明專利]一種靶向人高轉移肝癌細胞的單鏈DNA適配子及其應用

有效

• 申請號: 201210282163.4
• 申請日: 2012-08-09
• 公開（公告）號: CN102766634A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 汪付兵;李雁;劉少平
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12Q1/68;A61K31/713;A61K47/48;A61P35/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 余曉雪;王敏鋒

技術領域

本發明涉及肝癌轉移復發的診斷與治療技術領域，具體涉及一種靶向人高轉移肝癌細胞的單鏈DNA適配子及其應用，可用于肝癌轉移復發的靶向診療。

背景技術

肝細胞癌(HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，占全部惡性腫瘤的6%，中國是世界上肝癌死亡率最高的國家，占世界上肝癌總死亡人數的53%，在中國已成為惡性腫瘤第2位的死因。盡管近幾十年以來在肝癌診治和基礎研究方面均取得了長足的進步，但總體而言，肝癌的預后并沒有得到顯著的改善，5年生存率僅為5%左右。目前，臨床主要依靠定期復查甲胎蛋白AFP等血清學標志物和B超等影像學檢查來發現術后的轉移復發，但AFP陽性的肝癌只有70%-80%，B超無法發現小于1cm的肝癌，診斷均存在盲區，不能準確及時預測。因此進行篩選HCC轉移相關的靶分子用來預測并干預轉移復發的研究尤為重要。

近年來發展起來的SELEX（systematic?evolution?of?ligands?by?exponential?enrichment）技術是九十年代發展起來的一種新的體外篩選技術，它運用大容量的隨機寡核苷酸文庫，并結合體外PCR擴增技術，以指數富集與靶分子特異結合的寡核苷酸，經過多輪篩選，獲得高親合力、特異性強的寡核苷酸適配子（aptamers），已成功運用于許多靶分子的篩選，包括金屬離子、有機染料、蛋白質、藥物、氨基酸以及各種細胞因子等，甚至可用于完整的細胞、病毒、孢子和朊病毒等。這種方法具有簡便、快速、經濟等特點，與其他組合化學庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的適配子具有更高的親合性和特異性，具有良好的應用前景。

特異結合于腫瘤細胞的核酸適配子有利于腫瘤的診斷和治療。抗體可以特異識別腫瘤細胞的標志物，但缺點是分子大且具有免疫原性。人源化抗體等抗體工程技術更具前景，但因易被肽酶降解和有免疫反應而導致應用受限。適配子出現十多年來，已可應用于酶鏈寡核苷酸實驗、流式細胞儀、適配子芯片(aptamer?chip)、蛋白定量及蛋白純化等體外實驗，同時具有可在體內抑制生長因子和受體的相互作用或抑制酶活性等功能，還可進行體內成像等。適配子可作為診斷和治療試劑，用于診斷時可識別與結合特定靶分子，用于治療時可作為功能阻斷物質或者直接阻斷疾病進程。適配子可以作為腫瘤發生和發展過程中具有重要功能的蛋白質的直接抑制劑。

然而到目前為止，還沒有出現成功將SELEX篩選技術用于開發診斷及治療肝癌轉移復發的試劑的報道。

發明內容

針對現有技術中存在的不足，本發明的第一個目的在于提供一種能特異性地、高親和力地結合高轉移潛能肝癌細胞HCCLM9（Wu?et?al.Journal?of?Experimental&Clinical?Cancer?Research?2010,29:17,http://www.jeccr.com/content/29/1/17）膜表面的單鏈DNA適配子；

本發明的第二個目的在于提供一種上述單鏈DNA適配子耦聯熒光量子點形成的功能化生物分子探針，能識別組織切片中的肝癌細胞；

本發明的第三個目的在于提供一種上述單鏈DNA適配子耦聯磁性顆粒的復合物，能捕獲外周血模擬環境中的循環肝癌細胞；

作為一個總的技術構思，本發明還提供了一種上述單鏈DNA適配子或其衍生物在制備肝癌靶向診斷試劑中的應用。

作為一個總的技術構思，本發明還提供了一種上述單鏈DNA適配子或其衍生物在制備靶向性抗肝癌轉移復發藥物或抗肝癌轉移復發藥物靶向輸送載體中的應用。

為了實現上述諸目的，本發明采用了以下技術方案：

一種靶向人高轉移肝癌細胞的單鏈DNA適配子，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其篩選及初步的應用研究過程如下：

①隨機ssDNA文庫的構建和引物的合成

構建長度為76nt的隨機文庫，兩端為固定序列，中間為40個核苷酸隨機序列，庫容量大約為10¹⁵-10¹⁶，根據隨機ssDNA文庫兩端固定序列設計上下游引物。ssDNA文庫的序列：5’-ATC?CAG?AGT?GAC?GCA?GCA-（N40）-TGG?ACA?CGG?TGG?CTT?AGT-3’，其中N代表A，T，C，G四個隨機堿基；上游引物P1:5’-ATC?CAG?AGT?GAC?GCA?GCA-3’；下游引物P2：5’-ACT?AAG?CCA?CCG?TGT?CCA-3’；

②SELEX篩選過程