[發(fā)明專利]一種高F值金槍魚(yú)寡肽制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210280516.7
• 申請(qǐng)日: 2012-08-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102776262A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-11-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅紅宇;宋茹;杜帥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江海洋學(xué)院
• 主分類號(hào): C12P21/06
• 分類號(hào): C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/16;C12N11/10
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 吳輝輝;徐關(guān)壽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于寡肽制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高F值金槍魚(yú)寡肽制備方法。

背景技術(shù)

金槍魚(yú)(Tunas)?又叫鮪魚(yú)、吞拿魚(yú)，屬鱸形目(Perciformes)鯖科(Scombridae)，作為一種深海魚(yú)類，金槍魚(yú)不僅肉味鮮美，而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高，富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和維生素，以“純天然、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高”而享譽(yù)國(guó)際市場(chǎng)。金槍魚(yú)的主要加工種類有藍(lán)鰭金槍魚(yú)、長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)、黃鰭金槍魚(yú)和大眼金槍魚(yú)。浙江省是我國(guó)金槍魚(yú)加工中心，擁有全國(guó)最大的金槍魚(yú)加工基地，金槍魚(yú)除了鮮銷外，其加工產(chǎn)品的附加值非常高，一般經(jīng)過(guò)冷凍處理用于制作壽司及罐裝食品。金槍魚(yú)在加工過(guò)程中產(chǎn)生大量碎肉，這些碎肉同金槍魚(yú)的魚(yú)肉主體一樣營(yíng)養(yǎng)豐富，目前尚無(wú)有效的工業(yè)化深加工方法。?

高F值寡肽是由3～7個(gè)氨基酸殘基所組成的混合小肽混合物，F(xiàn)值是指混合物中支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，簡(jiǎn)稱BCAA）和芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸，簡(jiǎn)稱AAA）的摩爾比值，是為了紀(jì)念德國(guó)著名學(xué)者Fischer?在上個(gè)世紀(jì)70年代提出的“偽神經(jīng)傳遞質(zhì)假說(shuō)”而命名的。小肽分子與游離氨基酸相比具有滲透壓低、抗原性低等優(yōu)點(diǎn)，所以更容易被吸收。研究表明高F值寡肽能夠改進(jìn)肝臟疾病（肝硬化、肝性腦病），常被用于輔助治療肝性腦病以及改善手術(shù)后和臥床病人的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)狀況，另外，高F值寡肽還具有抗疲勞和醒酒等多種生物活性。但是，相對(duì)于水產(chǎn)蛋白及加工副產(chǎn)物蛋白水解液的抗氧化肽和ACE降壓肽研究而言，水產(chǎn)蛋白高F值寡肽的研究還較少，而以金槍魚(yú)碎肉為原料制備高F值寡肽的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

目前高F值寡肽制備主要采用二步酶解法，第一步酶切：在原料蛋白肽鏈的芳香族氨基酸處切割使芳香族氨基酸暴露出來(lái)；第二步酶切：將芳香族氨基酸切掉，釋放到水解液中為游離型，使寡肽剩下含量高的支鏈氨基酸。所以，酶解法制備高F值寡肽關(guān)鍵點(diǎn)之一是要選擇特異性蛋白酶，提高酶解效率，釋放芳香族氨基酸。

獲得高F值寡肽關(guān)鍵點(diǎn)之二是要最大限度地去除蛋白水解液中芳香族氨基酸，提高支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的比值（F值>20）。蛋白質(zhì)水解液中的芳香族氨基酸去除方法很多，如離子交換法、凝膠過(guò)濾法、膜分離法、活性炭吸附色譜法等，其中活性炭對(duì)苯丙氨酸、酪氨酸有選擇性吸附特性，利用這一特性，可將寡肽和芳香族氨基酸分離，而且從工業(yè)應(yīng)用角度考慮，活性炭吸附法更易推廣使用，適合大規(guī)模生產(chǎn)。

現(xiàn)有的活性炭吸附法都采用活性炭靜態(tài)吸附法，在酶解液中直接加入活性炭進(jìn)行吸附，這種方法洗脫效果有限，酶解液中有較多的活性炭殘留，吸附使用過(guò)的活性炭再生困難。

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發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種高F值金槍魚(yú)寡肽的制備方法，具有良好的酶解效率，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。?

本發(fā)明的具體技術(shù)方案是：??

一種高F值金槍魚(yú)寡肽的制備方法，其特征在于該制備方法包括以下步驟：

預(yù)處理：稱取解凍后的金槍魚(yú)碎肉，采用勻漿機(jī)勻漿兩分鐘，直到無(wú)大塊魚(yú)肉為止，然后按一定比例w/v=1:7加入蒸餾水，放在反應(yīng)器中，35°C保溫；

固定化酶制備：

稱取一定量的殼聚糖，用2%乙酸溶液至完全溶解，用注射器將制備好的殼聚糖凝膠按1:3?90%乙醇溶液中，凝結(jié)2h，加入5%戊二醛，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，在150rpm轉(zhuǎn)速下振蕩1h，用去離子水充分洗滌，至無(wú)戊二醛殘液，得到交聯(lián)好的載體；

在交聯(lián)好的載體中，加入一定量由pH?3.0的乳酸-乳酸鈉配置的胃蛋白酶溶液，于4℃冰箱中交聯(lián)10h，用蒸餾水洗滌，布氏漏斗抽濾得到固定化胃蛋白酶；

在交聯(lián)好的載體中，加入一定量由蒸餾水配制的木瓜蛋白酶溶液，于4℃冰箱中交聯(lián)10h，用蒸餾水洗滌，布氏漏斗抽濾得到固定化木瓜蛋白酶；

將固定化胃蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶裝配于一個(gè)兩層筒狀酶反應(yīng)器中，該酶反應(yīng)器由上下兩層旋轉(zhuǎn)筐連接而成，將固定化胃蛋白酶裝配在上面一個(gè)旋轉(zhuǎn)筐夾層中，將固定好的木瓜蛋白酶裝在下面一個(gè)旋轉(zhuǎn)筐夾層中；

酶解：讓反應(yīng)液依次流過(guò)這兩個(gè)旋轉(zhuǎn)筐，所述旋轉(zhuǎn)筐內(nèi)部設(shè)有主軸帶動(dòng)葉輪轉(zhuǎn)動(dòng)，使酶解液與固定化酶發(fā)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)，利于固定化酶與酶解液充分接觸；

其中，第一步酶解條件如下：調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至2.0，放入上層旋轉(zhuǎn)筐內(nèi)進(jìn)行酶解，酶解溫度為40℃，每隔半小時(shí)調(diào)節(jié)一次pH值，讓酶解液保持在pH2.0下進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為4小時(shí)；