[發(fā)明專利]水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的RAG2分子標(biāo)記RFLP鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210278244.7
• 申請日: 2012-08-07
• 公開（公告）號: CN102758021A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋昭彬;郭睿;楊世勇;張修月
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 成都天嘉專利事務(wù)所(普通合伙) 51211
• 代理人: 趙麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及魚類雜種的鑒定方法，具體涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的RAG2分子標(biāo)記RFLP鑒定方法。

背景技術(shù)

鲇形目魚類屬肉食性底層魚類，是魚類進(jìn)化中最發(fā)達(dá)的真骨魚類之一。南方鲇（又叫大口鲇）（Silurus?meridionalis?Chen）和鲇（Silurus?asotus?Linnaeus）均屬于鲇形目、鲇科、鲇屬，兩者味道鮮美、營養(yǎng)價值高，是我國各地主要養(yǎng)殖的高附加值經(jīng)濟(jì)魚類。南方鲇分布于我國珠江、閩江、湘江、長江等水系，是一種大型兇猛的肉食性魚類，具有生長快、個體大、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，喜棲息于開敞水體，以及灣沱、河底礫石河段，懷卵量大，產(chǎn)卵期長。鲇分布于除青藏高原及新疆外的全國各水系，體色隨棲息環(huán)境不同而有所變化，主要棲息于江河干流或較大的支流、大型湖泊和水庫等水體的中下層，其適應(yīng)性強(qiáng)，棲息于靜水或緩流水域，個體較小，生長快。南方鲇和鲇形體輪廓相似，小個體的南方鲇與鲇成體混同雜居，大個體與鲇隔離生活。據(jù)報道，人工繁殖的南方鲇群體中雄性比例非常低。調(diào)查顯示，當(dāng)雄性南方鲇缺乏時，可能進(jìn)行了雌性南方鲇與其他雄性鲇屬種類的雜交，從而在鲇魚生產(chǎn)中出現(xiàn)了物種間的雜交育種。

為了滿足社會生產(chǎn)的需要，獲得兼有以上2種魚優(yōu)良性狀的苗種，王朝明等（大口鲇與鲇魚的雜交試驗，淡水漁業(yè)，2004，34（6）:?41~43；三種鲇遺傳多樣性的RAPD分析，淡水漁業(yè)，2005，35（4）:?14~17）開展了南方鲇與鲇的雜交育種試驗，并做了一定的雜種鑒定工作，篩選出22個隨機(jī)引物用于南方鲇、鲇及其雜交F₁代三個群體多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜交F₁代繼承了大口鲇的52條特征帶和鲇的32條特征帶。然而，其鑒定工作所采用的RAPD標(biāo)記，受方法本身的限制，檢測效率低且重復(fù)性不高，嚴(yán)重影響了這一方法的推廣使用。此外，僅有龍華等（鲇、大口鲇及其雜交鲇血液生理生化指標(biāo)比較及轉(zhuǎn)鐵蛋白等位基因分析，長江大學(xué)學(xué)報（自科版），2006，3（2）:?161~164；?鲇、大口鲇及其雜交鲇的血型分析，水利漁業(yè)，2007，27（3）:?19~20）對南方鲇、鲇及其雜交鲇的血液生理、血型分析及同工酶等方面的研究。可見，有必要開展南方鲇、鲇及其雜交子代的分子標(biāo)記及鑒定技術(shù)研究，為南方鲇養(yǎng)殖和育種實(shí)踐中的雜種鑒定提供可靠方法。

PCR-RFLP作為傳統(tǒng)的分子標(biāo)記，在雜種鑒定領(lǐng)域，方法為依據(jù)目的基因序列，找出近緣種中同一基因的差異位點(diǎn)，設(shè)計限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，通過酶切產(chǎn)生長度不等的酶切片段，進(jìn)行限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP）分析，可以有效研究種群種質(zhì)、鑒定雜種。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的為鑒定南方鲇與鲇的雜種，從分子生物學(xué)層面上將形態(tài)上不易區(qū)分的雜種和純種進(jìn)行分辨。本發(fā)明以南方鲇、鲇及其雜交子代為研究對象，在鲇屬魚類中篩選設(shè)計了RAG2基因片段作為分子標(biāo)記，首次應(yīng)用RAG2基因片段的RFLP分析，成功鑒定了南方鲇、鲇及其雜交子代。

RAG2基因片段是核重組活化蛋白基因外顯子片段，這一基因種內(nèi)變異低并廣泛用于評價種內(nèi)遺傳和關(guān)系。本發(fā)明將RAG2基因片段的RFLP分析用于南方鲇、鲇及其雜交子代的鑒定，具有實(shí)驗快捷，操作簡便，鑒定直觀，無需測序的優(yōu)點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的RAG2分子標(biāo)記RFLP鑒定方法，其特征在于：應(yīng)用PCR擴(kuò)增后的基因片段在南方鲇與鲇之間存在的種間序列差異，據(jù)此篩選合適的限制性內(nèi)切酶，分析鑒定南方鲇、鲇及其雜交子代。

所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的RAG2分子標(biāo)記RFLP鑒定方法，包括以下步驟：

A?分別取南方鲇、鲇及其雜交子代樣本，提取基因組DNA；

B?分別以南方鲇、鲇及其雜交子代樣本的基因組DNA為模板，在RAG2基因片段特定引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；?

C分別對南方鲇、鲇及其雜交子代樣本的RAG2基因片段進(jìn)行限制性內(nèi)切酶?StuⅠ和XhoⅠ的酶切反應(yīng)；

D?利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR-RFLP產(chǎn)物，在一個泳道上同時出現(xiàn)南方鲇和鲇的兩條基因條帶，即為南方鲇和鲇的雜交種。

本發(fā)明所用樣本分為3類，鲇、南方鲇和雜交鲇（即子代），針對以上樣本分別使用上述2種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行2步酶切（一步用一種，參見下述具體方案），每種限制酶單獨(dú)酶切。如圖1和圖2所示的電泳圖是所有3類樣本依次用兩種限制酶酶切的圖譜。

所述的步驟B中的RAG2基因片段特定引物，其堿基序列為：