[發明專利]嵌合抗原受體iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ及其用途

無效

• 申請號: 201210275676.2
• 申請日: 2012-08-03
• 公開（公告）號: CN102775500A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 鄭駿年;張青;楊潔;方琳;趙鐵鎖;李連濤;李慧忠;張寶福;程乾;章龍珍;裴冬生
• 申請（專利權）人: 鄭駿年
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;A61K38/16;A61K47/48;A61P35/00
• 代理公司: 徐州市三聯專利事務所 32220
• 代理人: 周愛芳

技術領域

本發明屬于生物與新醫藥技術領域。具體是一種嵌合抗原受體iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ的制備。其制備涉及利用分子生物學技術，將編碼腫瘤穿透肽iRGD、抗人腎癌G250抗原的單鏈抗體、CD8的跨膜區和胞內區及CD28、CD137、CD3ζ的胞內信號結構域的核苷酸序列依次連接起來，得到編碼嵌合抗原受體iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ的融合基因片段，并在其5’末端插入信號肽Ig?kappa的編碼序列。然后將該基因片段插入慢病毒表達載體，包裝成慢病毒。利用該慢病毒感染人T淋巴細胞，使細胞表達該嵌合抗原受體。這種T淋巴細胞能夠識別腎癌細胞表面抗原G250，用于腎癌治療。

背景技術

嵌合抗原受體（chimeric?antigen?receptor，CAR）是模擬T細胞受體（T?cell?receptor，TCR）功能的人工受體，由抗原識別結構域（單鏈抗體）和T淋巴細胞的一系列信號結構域（來源于CD8、CD28、CD137、CD3ζ和FcR?γ等分子）依次連接而成。根據胞內信號結構含有結構域的不同，CAR被劃分為三代。第一代CAR僅含有一個胞內信號結構域（CD3ζ或FcR?γ）。為增強CAR修飾T淋巴細胞在體內的增殖和存活能力，一些共刺激分子（如CD28和CD137）的胞內信號結構域被加入到第一代CAR中，形成第二代CAR（含有一個共刺激分子）和第三代CAR（含有兩個共刺激分子）。CAR修飾的T淋巴細胞能夠通過其抗原識別結構域（單鏈抗體）識別腫瘤細胞表面抗原，然后通過胞內信號結構域將識別信號傳遞至胞內，激活T淋巴細胞的殺傷活性，殺死腫瘤細胞。

CAR修飾的T淋巴細胞治療腫瘤，是一種利用人體自身淋巴細胞進行的免疫治療手段，相對于目前臨床使用的放、化療來講，具有毒副作用較弱的特點。由于CAR修飾的T淋巴細胞通過其CAR的抗原識別結構域識別腫瘤細胞，然后啟動殺傷作用，因此具有靶向性的特點。由于CAR修飾的T淋巴細胞通過CAR的抗原識別結構域直接識別腫瘤細胞表面抗原，并通過來源于CD8、CD28、CD137和CD3ξ的信號結構域直接將識別信號傳遞至胞內，激活T淋巴細胞的殺傷活性，因此可以繞開常規細胞免疫的主要組織相容性復合體（major?histocompatibility?complex，MHC）的限制性。

嵌合抗原受體修飾的T淋巴細胞治療惡性血液病已經取得較好效果，但對實體瘤治療效果有限。主要原因是嵌合抗原受體修飾的T淋巴細胞穿透實體瘤的能力有限，所以增強其腫瘤穿透能力是增強CAR修飾T淋巴細胞對實體瘤治療效果的重要途徑。iRGD肽是一種具有腫瘤通透作用的短肽，其原理是：iRGD中的RGD三肽與腫瘤血管內皮細胞表面高表達的αv整合素（αv?integrins）結合，將藥物導向腫瘤部位；在細胞表面蛋白酶的作用下，氨基酸K和G之間的肽鍵被水解斷開，暴露出C末端規則（C?end?rule，CendR）基序（CRGDK）；CendR基序與腫瘤細胞表面的neuropilin-1結合，使腫瘤組織通透性增加，便于T淋巴細胞進入腫瘤組織內部。

G250是一種表達于腎癌細胞表面的腎癌特異性抗原，抗G250單克隆抗體（G250-McAb）能與所有的腎透明細胞癌（占腎癌的90%）及65%的非透明腎細胞癌結合，但不與正常腎細胞發生反應。利用¹³¹I標記G250-McAb定位腎轉移癌，90％以上的轉移癌，包括肝、肺、骨及淋巴結轉移均被發現，有些僅8mm沒被CT及MRI發現的微小腫瘤亦被顯示。G250-McAb與腎癌細胞結合的高特異性、高靈敏性，使其可應用于腎癌的靶向治療。將G250-McAb與GFP表達載體偶聯可使報告基因GFP轉染率大幅升高。因此，可以利用G250單鏈抗體（scFv）作為抗原識別結構域識別腎癌細胞表面抗原。

目前臨床上使用的CAR，其scFv大多來自于鼠源抗體，其修飾的T淋巴細胞在體內會引起人抗鼠scFv的免疫反應。此免疫反應會降低CAR修飾的T淋巴細胞在體內的增殖和存活能力，進而降低其治療效果。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供一種嵌合抗原受體

RGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ及其用途，本發明采用人源化抗人腎癌抗原G250scFv可以有效降低這種免疫反應，延長CAR修飾T細胞在體內的存活時間，提升治療效果。

本發明的技術方案如下：一種嵌合抗原受體