[發明專利]殺蟲蛋白質、其編碼基因及用途

有效

• 申請號: 201210272820.7
• 申請日: 2012-08-02
• 公開（公告）號: CN102796182A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 張愛紅;龐潔;楊進孝;牛瑞琪;董雷;龐雪兵;楊秋妹;傅學乾
• 申請（專利權）人: 北京大北農科技集團股份有限公司;北京大北農科技集團股份有限公司生物技術中心
• 主分類號: C07K14/325
• 分類號: C07K14/325;C12N15/32;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/21;C12N1/19;C12N7/01;A01K67/033;C12P21/02;C12N15/82;C12N15/84;A01H5/00;A01N47/44
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技術領域

本發明涉及一種殺蟲蛋白質、其編碼基因及用途，特別是涉及一種改造的PIC9殺蟲蛋白質、其編碼基因及用途。

背景技術

植物蟲害是導致農作物損失的主要因素，給農民造成重大的經濟損失，甚至影響到當地人口的生存狀況。為了防治植物蟲害，人們通常使用廣譜化學殺蟲劑和生物殺蟲制劑，但二者在實際應用中都具有局限性：化學殺蟲劑會帶來環境污染的問題，并導致抗藥性昆蟲的出現；而生物殺蟲制劑在環境中容易降解，在生產上需要重復施用，大大增加了生產成本。

為了解決化學殺蟲劑和生物殺蟲制劑在實際應用中的局限性，科學家們經過研究發現將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉入植物中，可獲得一些抗蟲轉基因植物以防治植物蟲害。PIC9殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是由蘇云金芽孢桿菌庫斯塔基亞種（Bacillus?thuringiensis?subsp.kurstaki，B.t.k.）產生的伴孢結晶蛋白，是不溶性晶體蛋白。

PIC9蛋白被昆蟲攝入進入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿性PH環境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉變成活性片段；活性片段和昆蟲中腸上皮細胞膜上表面上受體結合，插入腸膜，導致細胞膜出現穿孔病灶，破壞細胞膜內外的滲透壓變化及PH平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導致其死亡。

每年因植物蟲害造成的糧食損失巨大，例如玉米螟、小地老虎、玉米夜蛾或棉鈴蟲等。目前未發現PIC9殺蟲蛋白在植物中的表達水平和毒力的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種殺蟲蛋白質、其編碼基因及用途，所述PIC9殺蟲蛋白在植物中（尤其為玉米）具有較高的表達量和毒力。

為實現上述目的，本發明提供了一種殺蟲蛋白質，包括：

（a）具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或

（b）在（a）中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有殺蟲活性的由（a）衍生的蛋白質；或

（c）通過包含SEQ?ID?NO:1的核苷酸序列的核酸分子的表達產生的蛋白質；或

（d）通過包含核苷酸序列的核酸分子的表達產生的蛋白質，所述核苷酸序列具有在嚴格條件下與SEQ?ID?NO:1的核苷酸序列雜交的互補序列；或

（e）通過包含核苷酸序列的核酸分子的表達產生的蛋白質，所述核苷酸序列與（d）的核苷酸序列同類編碼。

所述嚴格條件可為在6×SSC（檸檬酸鈉）、0.5%SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜1次。

為實現上述目的，本發明提供了一種殺蟲基因，包括：

（a）編碼具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的核苷酸序列；或

（b）編碼氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列為在（a）中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有殺蟲活性的由（a）衍生的蛋白質；或

（c）具有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；或

（d）在嚴格條件下與（c）限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質的核苷酸序列；或

（e）與（d）的核苷酸序列同類編碼。

所述嚴格條件可為在6×SSC（檸檬酸鈉）、0.5%SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜1次。

為實現上述目的，本發明還提供了一種表達盒，包含在有效連接的調控序列調控下的所述殺蟲基因。

為實現上述目的，本發明還提供了一種包含所述表達盒的重組載體。

為實現上述目的，本發明還提供了一種包含所述殺蟲基因的轉基因宿主生物，包括植物細胞、動物細胞、細菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。

進一步地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。

為實現上述目的，本發明還提供了一種產生殺蟲蛋白質的方法，包括：

獲得所述轉基因宿主生物的細胞；

在允許產生殺蟲蛋白質的條件下培養所述轉基因宿主生物的細胞；

回收所述殺蟲蛋白質。