[發明專利]一種多肽片段及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201210271177.6
• 申請日: 2012-08-01
• 公開（公告）號: CN102807612A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 李臣鴻;汪俊漢;陳正望
• 申請（專利權）人: 中南民族大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/16;A61K38/17;A61P5/50;A61P3/10
• 代理公司: 武漢華旭知識產權事務所 42214
• 代理人: 劉榮

技術領域

本發明涉及一種磷脂酰乙醇胺結合蛋白截短后的片段，該多肽片段具有刺激分泌胰島素的作用，本發明同時還提供了上述多肽片段的制備方法。

背景技術

磷脂酰乙醇胺結合蛋白（PEBP）是一類能與磷脂酰乙醇胺（PE）結合的蛋白，該家族的所有成員都含有與PE結合的保守區域，PEBP家族種類來源廣泛，包括果蠅觸覺的氣味結合蛋白、盤尾絲吸蟲感染后的免疫血清識別的抗原Ag16，酵母中抑制CDC25突變的因子CEN，哺乳動物的體內組織細胞液中。PEBP家族成員功能廣泛，涉及到抵抗凋亡，膜形成，精子的成熟等各方面的生理功能。

糖尿病是一種血液中的葡萄糖容易堆積過多的疾病。國外給它的別名為“沉默的殺手”（Silent?Killer），特別是成人型糖尿病。四十歲以上的中年人染患率特別高，在日本，四十歲以上的人口中發病率占10%，即十人當中就有一位糖尿病患者，一旦患上糖尿病，將減少壽命十年之多，可能發生的并發癥遍及全身。目前主要治療糖尿病的藥物都是促進胰島素分泌的藥物和直接補充胰島素，但是這些藥物要么效果不好要么會產生胰島素抵抗性。所以尋找新的治療糖尿病的藥物一直在進行中。

發明內容

本發明提供了一種多肽片段，經檢測后發現其為磷脂酰乙醇胺結合蛋白截斷后的片段，由磷脂酰乙醇胺結合蛋白93-124位的氨基酸殘基組成，其氨基酸序列如下：KGNDISSGTVLSDYVGSGPPKGTGLHRYVWLV。

本發明同時還提供了如上所述的多肽在生物醫藥上被認可的經修飾的多肽。

本發明提供了上述多肽的制備方法，包括以下步驟：（1）、將豬腸道洗凈后浸入沸水中浸泡3～7分鐘，浸泡完成后取出冷凍并剁碎，然后在0～10°C條件下用醋酸對腸道進行浸取后過濾得浸出液，用鹽酸對浸出液中的浸出物洗脫并抽濾得耐熱腸多肽；

（2）、將耐熱腸多肽溶解于水中，加入抗氧化劑及足量異丙醇溶液，室溫下充分靜置后離心除去沉淀，然后再加入足量溫度為-25℃～-15℃的異丙醇溶液并在-25℃～-15℃條件下充分靜置后抽濾去除沉淀，將所得濾液的PH值調節為5.8～6.1，再在-25℃～-15℃條件下充分靜置后抽濾得白色沉淀，將白色沉淀充分洗滌后即制得粗肽；

（3）、將步驟（2）中制得的粗肽溶解于醋酸溶液中制得肽溶液，將肽溶液過柱層析分離得到分離物，選取分離物中具有刺激胰腺分泌胰島素功能的一份，將其凍干即得粗提取物；

（4）、將粗提取物溶解于碳酸氫銨溶液中并攪拌，離心后去除沉淀得上清液，將所得上清液過柱層析并采用PH值為8.0、濃度為0.02mol/L的碳酸氫銨溶液進行洗滌，洗滌后得到的洗滌物凍干，再將洗滌物經過兩次高效液相色譜分離后，將分離物凍干即制得權利要求1所述氨基酸序列的多肽。

步驟（1）中醋酸的濃度為0.5mol/L，鹽酸的濃度為0.2mol/L。

步驟（2）中抗氧化劑為硫二甘醇，添加量為1.2毫升；洗滌分兩次進行，第一次洗滌選用異丙醇溶液，第二次洗滌選用乙醚溶液，第二次洗滌完成后將白色沉淀放入真空環境中使乙醚在真空中蒸發。

所述步驟（4）中的兩次高效液相色譜分離中，第一次分離所用洗提液為0.1％的三氟乙酸水溶液，第二次分離所用洗提液為0.1％的三氟乙酸的乙腈溶液。

本發明同時還提供了上述多肽及其藥學上可接受的鹽的用途，用于制造刺激胰腺分泌胰島素的藥物。

本發明提供的多肽以及其在生物醫藥上被認可的經修飾的多肽，能夠有效的刺激胰腺細胞分泌胰島素，與目前的治療糖尿病藥物中采用最多的高糖相比，本發明提供的多肽的效果更明顯。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中的粗肽層析分離結果圖；

圖2為本發明實施例1中第二次高效液相色譜分離結果圖；

圖3為本發明提供的多肽的氨基酸序列圖；

圖4為本發明提供的胰腺刺激試驗的實驗結果圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做詳細具體的說明。

實施例1

本實施例中采用以下制備步驟：

（1）、取30千克新鮮豬腸，將豬腸道洗凈后浸入沸水中浸泡4分鐘，浸泡完成后取出冷凍并剁碎，然后在5°C條件下用0.5mol/L的醋酸對腸道進行浸取后過濾得浸出液，然后用0.2mol/L的鹽酸對浸出液中的浸出物洗脫并抽濾得耐熱腸多肽約30克，耐熱腸多肽的產率約為豬腸濕重的0.01%。