[發明專利]彎曲菌分離、鑒定的試劑盒、制備和應用

無效

• 申請號: 201210268442.5
• 申請日: 2012-08-01
• 公開（公告）號: CN102816831A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 許學斌;袁政安;金匯明
• 申請（專利權）人: 上海市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26;C12Q1/04
• 代理公司: 上海浦東良風專利代理有限責任公司 31113
• 代理人: 張勁風

技術領域

本發明涉及彎曲菌分離、鑒定的試劑盒、制備和應用，彎曲菌屬中包括空腸彎曲菌或非空腸彎曲菌等彎曲菌的同步分離和鑒定方法，利用選擇性分離培養基對應生長的彎曲菌典型菌落形態、簡易生化和特異性酶-底物反應組合試驗鑒定空腸彎曲菌或非空腸彎曲菌在內的其他彎曲菌的試劑盒和使用方法。

背景技術

彎曲菌屬目前有30多個種，廣泛寄生在自然界中的飛鳥和養殖的禽、畜動物中的腸道（結腸或空腸部位），長期定殖并隨排泄物污染環境和食品，其中的空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、海鷗彎曲菌屬于已知的禽、畜動物類肉類制品明確檢疫的病原菌，同時，也是能引起食源性傳播和暴發的重要病原菌之一。國內的許多實驗室（包括臨床實驗室和公共衛生實驗室）在實際工作中無法通過可選擇的常規微生物分離方法和材料達到分離空腸彎曲菌等彎曲菌的預期效果，反而受制于彎曲菌微需氧的苛氧條件、標準菌株不易保存和選擇性培養基的批間質控要求繁瑣、敏感性和特異性低以及缺少簡單有效的對疑似菌落篩選方法和依賴鑒定用自動化生化反應試劑材料所需的昂貴費用，既費工又費時。本發明是基于傳統細菌學技術簡化，經提煉、加入創新材料組合成的檢測程序，包括對多種復雜樣品的預處理和增值，使用選擇性平板的篩選、甄別包括空腸彎曲菌在內的所有彎曲菌的典型菌落，結合簡易快速鑒別方法和特異性酶-底物反應組合試驗在2個培養周期內鑒定空腸彎曲菌或非空腸彎曲菌的試劑盒和篩選方法，較之現階段使用的傳統分離平板和鑒定技術必須依賴自動化生化鑒定儀器或分子生物學為主的方法更具有易學、綜合成本低、操作簡單、快速、無需依賴特殊儀器且有特異性、準確性及陽性預期值高的優點。適用糞便（或者糞便拭子）、食品、環境水樣等多種標本中包括空腸彎曲菌或非空腸彎曲菌的同步分離和鑒定。

發明內容

本發明的目的是提供一種可利用彎曲菌屬所有不同種細菌的生物學特性和酶反應試驗鑒定的彎曲菌分離、鑒定的試劑盒、制備和應用。主要解決對空腸彎曲菌和非空腸彎曲菌等彎曲菌分離方法存在的漏檢率高、鑒定步驟繁復且成本較高、篩選效能不夠直觀的技術難題。本發明針對多種不同類型標本分別使用可選擇性增菌液或專一性分離平板配合簡單的生長條件甄別模式、獨特的革蘭染色形態和細菌特異性呼吸酶-底物反應特征綜合建立而成的一套行之有效的分離和特異性鑒別試驗，達到對包括空腸彎曲菌和非空腸彎曲菌等彎曲菌的分離、篩選和準確鑒定的效果。

本發明的技術方案為：彎曲菌分離、鑒定的試劑盒及其制備方法，包括：

1、選擇性增菌液Ⅰ（衛斯理肉湯）：基礎成分：胰化酪蛋白胨20.0g，N,N-二羥乙基甘氨酸緩沖液（Bicine?buffer）?10.0g（sigmaB3876），氯化鈉5.0g，酵母浸出物?2.5g，瓊脂粉?1.0g，亞硫酸鐵?0.25g，Na₂S₂O₃?0.25g，丙酮酸鈉?0.25g，蒸餾水983.75ml。堿性高鐵血紅素溶液?6.25ml（每100ml配方：高鐵血紅素0.32g，0.15N氫氧化鈉溶液?100ml溶解混勻后，5磅30分鐘，108℃冷卻備用），10ml抗生素組合：氨曲南10mg/L，兩性霉素B2mg/L，萬古霉素10mg/L。肉湯基礎經15磅15分鐘（121℃）滅菌后冷卻至50℃加入高鐵血紅素溶液和抗生素組合液后分裝225ml/瓶備用。

2、選擇性增菌液Ⅱ：按照上述培養基分裝9ml/管，備用。

3、改良卡爾馬里（KARMALI）瓊脂平板：成分：活性炭4.0g，哥倫比亞瓊脂基礎990.0ml，一起加熱溶解經15磅15分鐘（121℃）滅菌后冷卻至50℃加入抗生素添加劑10ml（丙酮酸鈉50.0mg，放線菌酮50.0mg，頭孢哌酮16.0mg，氯化鐵血紅素16.0mg，萬古霉素10.0mg），調整pH至7.2（按冷卻至25℃后測量值為標準）。傾注無菌平板置冰箱中，備用。

4、哥倫比亞血平板：哥倫比亞血瓊脂基礎950ml：特殊蛋白胨23.0g，瓊脂份10.0g，氯化鈉5.0g，淀粉1.0g，加蒸餾水950ml煮沸3次后冷卻后調整pH至7.3（按冷卻至25℃后測量值為標準）經15磅15分鐘（121℃）滅菌后冷卻至50℃加入50ml無菌脫纖維綿羊血，混勻后傾注無菌平板置冰箱中，備用。