[發明專利]檢測牛凝血因子XI基因第9外顯子內15bp插入突變的試劑盒

無效

• 申請號: 201210266722.2
• 申請日: 2012-07-30
• 公開（公告）號: CN102776288A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 張毅;王雅春;李強;張沅;吳蒙;徐仙洲;俞英;孫東曉;張勝利
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明涉及遺傳學和分子生物學領域，具體地說，涉及一種檢測牛凝血因子XI基因第9外顯子內15bp插入突變的試劑盒。

背景技術

凝血是血液由液體狀態轉變為不流動的凝膠狀態的過程，是生物體天然的自我保護機制，能阻止血液從破損的血管中流失。除血小板外，所有參與凝血過程的物質統稱為凝血因子，目前已知的凝血因子有20余種，包括傳統的因子I-XIII，以及PK、HMWK等。當血管內皮細胞受到創傷，組織因子等蛋白與血液接觸，凝血會立即啟動。首先血小板流向創傷點堆積形成栓塞，稱為初級止血反應；同時，血漿中的各種凝血因子發生級聯反應形成纖維蛋白，在血小板栓塞上形成緊密的纖維蛋白網，該過程稱為次級止血反應。血液凝固是一系列凝血因子連鎖反應的結果，其特點是當凝血過程被激活時，其中一個凝血因子以其上游凝血因子為底物，使之激活為具有活性的酶，而該酶又催化激活下一個因子。凝血異常將增加失血或血栓形成的風險。

牛凝血因子XI缺失（Factor?XI?deficiency）最早（1969年）發現于美國荷斯坦牛中（Kociba等,1969），此后，1975年在加拿大也發現一頭患病的荷斯坦公牛（Gentry等,1975）。該遺傳缺陷病的臨床表現為血凝時間延長，血漿中XI因子活性降低。雜合個體除因注射、去角、閹割等損傷而發生出血癥外（嚴重的需要輸血），出血可能性相對較小，而隱性純合子出血情況較為嚴重，其新生犢牛大多死亡。其分子致病機理是牛27號染色體上的凝血因子XI（Factor?XI）基因第12外顯子上一個76bp的插入造成（Marron等,2004）。

2005年日本科學家報道了日本黑牛中一種新的凝血因子XI突變。在Factor?XI基因的第9外顯子上有15bp的插入，造成凝血活性降低（Kunieda等,2005）。同時，報道了一種檢測該變異的方法。其基本原理是，在該突變兩側設計引物，通過聚合酶鏈式反應擴增目的片段，進而通過瓊脂糖凝膠電泳方法進行基因型判定。然而，在實際應用中，由于瓊脂糖凝膠分辨率低，而該目的片段的野生型與突變型的條帶只相差15bp，因此不易區分，導致出現假陰性的結果。此外，該檢測方法所需高濃度瓊脂糖凝膠的制作過程也較為繁瑣，且電泳時間長。

發明內容

本發明的目的是克服現有檢測方法中易出現假陰性結果的缺陷，提供一種能夠準確高效地檢測牛凝血因子XI基因外顯子9內15個核苷酸插入突變的試劑盒。

為了實現本發明目的，本發明首先提供一種用于檢測牛凝血因子XI基因第9外顯子內15bp插入突變的PCR引物組合，其為：

引物對1：

a）上游引物wild-F5’-CTGCTGTGCAGTGTTCTGCC-3’；

b）下游引物wild-R5’-GGAGCGTCTATGGGACTTGA-3’；和

引物對2：

a′）上游引物mutant-F5’-TGCAAGCCCTTTCTTCTGAT-3’；

b′）下游引物mutant-R5’-AATGGCATATATTCTGCACA-3’。

引物對1的上游引物跨越了插入片段區域，但不包含插入片段，因此僅能與野生型等位基因序列特異結合，特異性地擴增野生型等位基因；而突變型等位基因沒有擴增產物。

引物對2的下游引物包含插入片段的序列，因此僅能與突變型等位基因序列特異結合，特異性地擴增突變型等位基因；而野生型等位基因沒有擴增產物。

本發明還提供含有上述引物組合的檢測牛凝血因子XI基因第9外顯子內15bp插入突變的試劑盒。

前述試劑盒中還包括dNTPs、Taq?DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應緩沖液中的一種或多種。

更優選地，前述試劑盒還包括標準陽性模板。

本發明進一步提供上述PCR引物組合或試劑盒在檢測牛凝血因子XI基因第9外顯子內15bp插入突變中的應用，包括步驟：1）提取待測牛的基因組DNA；2）以步驟1）中提取的DNA為模板，分別采用引物對1和引物對2，進行PCR擴增反應；3）分析PCR產物。

其中，步驟3）具體為：