[發(fā)明專利]一種制備高純度低分子肝素鈉的工藝

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210265494.7
• 申請日: 2012-07-30
• 公開（公告）號: CN102775523A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡永紅;沈飛;于輝;李棟蕓;馮旌;李佼佼;楊文革
• 申請（專利權(quán)）人: 南京新百藥業(yè)有限公司;南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C08B37/10
• 分類號: C08B37/10
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;袁正英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物藥用原料的制備純化方法，屬于生物工程領(lǐng)域，具體是一種制備高純度低分子肝素鈉的工藝。

背景技術(shù)

肝素鈉是一種富含陰離子的粘多糖硫酸酯，由動物體內(nèi)的肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生，因最初從肝臟中提取，故名肝素。臨床使用的肝素是從動物腸、肺粘膜、血管壁等處提取獲得的鈉（鋰）鹽，肝素鈉（鋰）具有抗凝血、抗炎、抗癌等多種生物學(xué)功能，但長期使用會有諸如出血、骨折等負(fù)作用。20世紀(jì)80年代初期發(fā)現(xiàn)低分子肝素鈉（LMWH，<8000Da）具有更強的活性和較小負(fù)作用，成為主要的臨床抗凝血藥。

目前國外已有10多種LMWH相繼問世，全球四大制藥企業(yè)均有該類產(chǎn)品的銷售，我國是主要的肝素原料國，產(chǎn)量約占全球的一半。應(yīng)用于臨床的LMWH是由普通肝素為原料制備獲得,制備方法主要有生物酶法、化學(xué)裂解法兩種。它們各有優(yōu)勢，肝素酶降解反應(yīng)條件溫和、專一性高、副產(chǎn)物少而且引入一個紫外生色團，檢測方便，但酶的價格昂貴，難以跨越工業(yè)生產(chǎn)的界線。化學(xué)裂解法不可避免的會改變肝素鈉的結(jié)構(gòu)、影響活性等。中國專利（授權(quán)號CN1096034）公開了一種純化的肝素裂分其制備方法和含有它們的藥物組合物。純化的肝素裂分通過如下步驟制備：向肝素鈉中加入亞硝酸鹽，pH1～5處理20～50分鐘，再在堿介質(zhì)中以硼氫化鈉還原，用HCL破壞過量硼氫化鈉并用乙醇沉淀分級，將得到的溶液暴露在紫外照射系統(tǒng)下，溫度為5℃～50℃,pH為3～8，色譜純化，最后用氯化鈉和乙醇沉淀分離得降解肝素鈉。美國專利（公開號3099600）公開了一種色譜技術(shù)分離純化肝素鈉的方法：將肝素鈉粗品溶于緩沖溶液中，加入5～12倍肝素鈉重量的離子交換樹脂TEAM-cel?lulose或DEAE-cellulose，后用緩沖液洗滌，鹽洗脫，乙醇沉淀、干燥得產(chǎn)品。上述方法為工業(yè)上典型的制備及純化肝素鈉的過程，生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高，而且沒有提及對肝素鈉的結(jié)構(gòu)類似物多硫酸軟骨素這一主要雜質(zhì)的去除方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的為了改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種制備高純度低分子肝素鈉的工藝；該發(fā)明提供一種簡便的低分子肝素鈉制備、純化技術(shù)，制得的低分子肝素鈉平均分子質(zhì)量在4.5KDa左右，效價不低于180U/mg,高于中國藥典要求的170U/mg，且依據(jù)中國藥典肝素鈉檢測標(biāo)準(zhǔn)檢測合格。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種制備高純度低分子肝素鈉的工藝，其具體步驟如下：

（1）將粗品肝素鈉溶于NaCl溶液中，機械攪拌至肝素鈉全部溶解，向溶液中加入堿液直至產(chǎn)生沉淀，靜置，過濾除去不溶物，得濾液；

（2）將步驟（1）中濾液以堿液調(diào)pH至9.5～10.5，加入H₂O₂溶液，在10～30℃下反應(yīng)2.5～3.5小時，得反應(yīng)液；

（3）將步驟（2）得到的反應(yīng)液升溫至30～50℃，此后每隔2.5～3.5小時補加H₂O₂溶液，并調(diào)節(jié)pH；補料后共反應(yīng)15～21h；

（4）向步驟（3）得到的反應(yīng)液中加入吸附劑，磁力攪拌，過濾除不溶物，得濾液；

（5）將步驟（4）中的濾液通過平衡好的凝膠色譜柱，收集低分子量的肝素鈉洗脫液；

（6）將步驟（5）中的低分子量的肝素鈉洗脫液用弱堿性離子交換樹脂吸附，分別以三種濃度的NaCl溶液洗脫，收集第一種（最低）、第三種（最高）濃度的NaCl洗脫液并混合；

（7）將步驟（6）中的混合洗脫液，在磁力攪拌下降溫至－5～8℃，再用乙醇沉淀、真空干燥得產(chǎn)品。

優(yōu)選步驟（1）中NaCl溶液的質(zhì)量百分濃度為1.2～1.8%；NaCl溶液的用量為2～3mL/g肝素鈉粗品量；靜置時間1～2小時；優(yōu)選步驟（1）和（2）的堿液均為NaOH或KOH溶液；堿液的濃度為1～1.5mol/L。

優(yōu)選步驟（2）和（3）中所加入的H₂O₂溶液和NaCl溶液的體積比為3～5：100；步驟（2）中H₂O₂溶液的濃度為1～5mol/L，步驟（3）中H₂O₂溶液的濃度為1～3mol/L。步驟（3）中每次補加完H₂O₂溶液后測定pH，使pH在6.8～7.5之間。

優(yōu)選步驟（4）中所述的吸附劑為活性碳、皂土或硅酸鹽；吸附劑的加入量為3～5g/100mlNaCl溶液量。