[發明專利]確定樣品纖維素酶活性的方法

無效

• 申請號: 201210264262.X
• 申請日: 2012-07-27
• 公開（公告）號: CN102796806A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 楊金龍;鄭儀;程書;張耕耘
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因研究院;深圳華大基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/54
• 分類號: C12Q1/54;C12Q1/34
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發明涉及生物化工領域，更具體地，本發明涉及樣品纖維素酶活性的方法。

背景技術

纖維素降解與相關微生物纖維素酶活力密切相關。目前，國際上比較通用的測定纖維素酶活力的方法是1987年T.K.Ghose發表在Pure?&?Appli.Chem上的《纖維素酶活力的測定方法》，是國際純化與應用化學聯合會（IUPAC）頒布的權威方法，通過參照將其并入本文。其基本原理是纖維素酶水解纖維素產生的纖維二糖、葡萄糖等還原糖能將堿性條件下的3,5-二硝基水楊酸（DNS）還原，生成棕紅色的氨基化合物，在540nm波長處有最大光吸收，在一定范圍內還原糖的量與反應液的顏色強度呈比例關系，利用比色法測定其還原糖生成的量就可測定纖維素酶的活性。其中葡聚糖內切酶的活性可通過羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl?cellulose?sodium，CMC）酶活測定方法檢測，全酶（包括葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶）的活性可通過濾紙（相當于纖維素）酶活測定法檢測。

然而，目前確定纖維素酶活性的方法仍有待改進。

發明內容

本發明是基于發明人的下列發現而完成的：

目前CMC酶活測定方法的國際標準體系含有0.5ml酶、0.5ml2重量%CMC、3ml?DNS和20ml蒸餾水。濾紙酶活測定方法的國際標準體系包括0.5ml酶、1ml?PH4.8的0.05M醋酸鈉-醋酸緩沖液（在本文中，有時簡稱為“醋酸緩沖液”）、1cm×6cm濾紙、3ml?DNS和20ml蒸餾水。為了操作方便，在具體研究或技術發明中，大都以上述國際標準方法為基礎進行一些調整。如關于CMC酶活測定方法，有研究采用96孔板120μl體系，其包括30μl酶、30μl2%CMC和60μl?DNS。關于濾紙酶活測定方法，有研究采用96孔板200μl體系，其包括20μl酶、40μl0.05M醋酸緩沖液、直徑7mm濾紙圓片和120μl?DNS，在DNS顯色后吸出顯色溶液36μl+160μl蒸餾水，測A₅₄₀值。然而，當需要進行大規模、高通量的纖維素酶活測定時，傳統的反應體系則比較耗時費力。

本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一或至少提供一種有用的商業選擇。為此，本發明的一個目的在于提出一種具有能夠有效確定樣品纖維素酶活性的方法。

根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法包括：在反應容器中，將待測樣品與纖維素酶底物混合；將所述反應容器置于適于纖維素酶作用的條件下，持續第一預定時間；向所述反應容器中加入顯色底物，并將所述反應容器置于適于顯色的條件下，持續第二預定時間；確定所述反應容器中的葡萄糖含量；基于所述葡萄糖含量，確定所述樣品的纖維素酶活性。利用根據本發明實施例的方法，能夠有效地確定樣品的纖維素酶活性。根據本發明的實施例，利用根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法與利用國際標準方法（IU）針對同一種同一濃度的商品酶，所測定的酶活結果一致。與現有的其它方法相比，根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法能同時測定CMC酶活和濾紙酶活，測定的酶活值與國際標準方法（IU）測定結果一致，具有可靠性，并且穩定性好。根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法，反應與顯色測定在相同的容器，例如同一塊96孔板上進行，不需要更換反應容器，操作簡單，測定樣品和試劑用量少、測定速度快，能同時測定大量樣品，實現高通量。

另外，根據本發明的實施例，上述確定樣品纖維素酶活性的方法還可以具有下列附加技術特征：

在本發明的一個實施例中，反應容器為96孔板。

在本發明的一個實施例中，纖維素酶底物為選自濾紙和含有羧甲基纖維素鈉的溶液的至少一種。

在本發明的一個實施例中，濾紙的尺寸為6×10平方毫米，含有羧甲基纖維素鈉的溶液含有2重量%的羧甲基纖維素鈉和0.05M的醋酸緩沖液，其pH值為4.8。

在本發明的一個實施例中，纖維素酶底物為含有羧甲基纖維素鈉的溶液，反應容器為96孔板，其中，在反應容器中，將待測樣品與纖維素酶底物混合進一步包括：在96孔板的至少一個孔中，首先加入50微升待測樣品，然后加入50微升所述含有羧甲基纖維素鈉的溶液。

在本發明的一個實施例中，反應容器為96孔板，纖維素酶底物為濾紙，其中，在反應容器中，將待測樣品與纖維素酶底物混合進一步包括：在96孔板的至少一個孔中，依次加入50微升待測樣品和50微升pH4.8，0.05M的醋酸緩沖液；以及將所述濾紙浸入所得到的混合溶液中。