[發明專利]膠體金法丙型肝炎病毒(HCV)快速診斷試劑盒

在審

• 申請號: 201210259659.X
• 申請日: 2012-07-25
• 公開（公告）號: CN103575884A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 韓濤;高博;孫偉;李永濤;謝勝華;劉寶君
• 申請（專利權）人: 上海紐卓生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/576
• 分類號: G01N33/576
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及丙型肝炎病毒的檢測。

背景技術

丙型肝炎病毒(HCV)在1989年由美國Choo等人第一次從受感染的黑猩猩血液中分離出來，據世界衛生組織統計，全球估計約有1.7億人被HCV感染，我國約有四千萬左右。丙型肝炎慢性轉化率為50％-75％，其中約有20％可進一步發展為肝硬化、肝纖維化、肝癌，嚴重危害人類健康。然而到目前為止，世界上仍沒有疫苗問世，也無有效地治療方法，臨床普遍運用的聚乙二醇干擾素聯合利巴韋林的方法對相當一部分人是無效的，由于HCV的復雜性，因此可能在短時間難有有效地疫苗問世，預防感染可能是有效的方法。HCV的傳播途經主要是通過血源傳播，其中包括輸血后感染和使用血液制品引起的感染，約占輸血后肝炎的70％。因此從血源預防對于減少輸血引起的感染將是一個重要的手段。

酶聯免疫法(ELISA)HCV抗體診斷時目前常用的HCV檢測方法，到目前為止已經發展到了第三代，在國內普遍采用HCV的core、NS3、NS4和NS5抗原混合包被進行檢測，在國外增加入了E抗原的配伍使用。ELISA法檢測有很多不足之處，比如檢測時間長、穩定性相對較低，需要專業的技術人員操作以及重要的靈敏度和特異性問題，需要對其進一步改進，另外現在市售的ELISA法基本都是采用間接法檢測，采用雙抗原法可能更好的解決其靈敏度和特異性問題，但是由于抗原標記影響抗原的一些問題，因此到目前為止，還沒有成功的檢測試劑盒出售。

免疫層析膠體金法是新型的免疫學檢測方法，它具有檢測方便、快速、穩定性對檢測人員要求不高的優點，越來越受到研究者的關注，然而不足的可能是其靈敏度比ELISA法稍低，且開發難度大、對抗體、抗原要求純度和穩定性要求更高。

到目前為止，國內外雖有部分公司研制開發了膠體金法HCV抗體診斷試劑盒，由于E抗原容易變性等問題，大多公司還是沒有將E抗原運用到檢測中，這對于一部分假陰性的檢測是非常不利的。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速檢測丙型肝炎病毒的試劑盒。

本發明的目的就是針對市場現有產品中存在的缺陷，提供了一種快速定型檢測血液或血漿中HCV抗體檢測膠體金法檢測試劑盒，為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為：膠體金法HCV抗體檢測試劑盒，包括了在無紡布或玻璃纖維包被的溶有膠體金標記的鼠抗人抗體，陽性檢測線上硝酸纖維膜包被的是按一定比列配伍的HCV抗原，包括core、E1、E2、NS3、NS4、NS5六個蛋白，陰性檢測線上硝酸纖維膜包被的是羊抗鼠抗體。

以上所用的鼠抗人抗體和羊抗鼠抗體為無色透明液體，濃度為2mg/ml，用SDS-PAGE檢測僅有一條帶，純度大于95％；

所用的HCV混合抗原為無色透明液體，混合抗原包括HCV的core，E1，E2，NS3，NS4，NS5等6個抗原，混合前的單抗原通過高壓液相層析檢測僅有一個主峰，SDS-PAGE檢測一條帶，純度大于95％；

HCV混合抗原用碳酸鹽緩沖液和終濃度為3％的BSA混合液將core、E1、E2、NS3、NS4、NS5按照15∶7∶3∶12∶10∶9的比例進行配伍；

本發明的另一個目的是提供膠體金法HCV抗體檢測試劑盒的制備方法，具體的實施方法如下。

具體實施方式

1.主要材料

1.1試劑：

一定比例配伍的HCV?core，E1，E2，NS3，NS4，NS5等抗原皆為基因工程重組表達純化抗原，為自產(具體生產方法見下面方法)；鼠抗人抗體和羊抗鼠抗體為北京康為世紀公司生物有限公司產品；氯金酸為sigma公司產品；硝酸纖維膜為美國PALL公司產品；牛血清白蛋白(BSA)為Roche公司產品；其他試劑全部為分析純，購自國藥集團。

1.2臨床血清：在醫院或血站收集的600份血清，檢測出的HCV陽性400份，陰性200份。

1.3現有市場產品：HCV檢測試劑盒分別為科華的酶聯免疫法(立可讀)試劑盒和廈門波生生物HCV抗體膠體金法檢測試劑盒。

2.方法：

2.1膠體金墊的制備：