[發明專利]一種動物通用人工紅細胞的制備方法

有效

• 申請號: 201210255654.X
• 申請日: 2012-07-23
• 公開（公告）號: CN102836126A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: 賈杏林;丁維;李曉云;萵小慶;周放
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: A61K9/127
• 分類號: A61K9/127;A61K38/42;A61P7/08;A61J3/00
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所 43114
• 代理人: 袁靖

技術領域

本發明涉及一種以豬血紅蛋白為基礎的血紅蛋白脂質體即一種動物通用人工紅細胞的制備方法，屬于生物醫學領域。

背景技術

輸血是臨床上一項重要的搶救和治療措施，尤其在急救醫學中的作用是其它任何手段無法完全替代的，其應用非常廣泛。在動物臨床醫學中，輸血療法也是很重要的一種治療方法。但由于輸血可能導致的疾病的感染和傳播，血液貯存期短，動物血型種類繁多和血液來源緊張以及動物相關血庫尚未建立等原因，動物輸血療法的應用受到了限制。目前國內寵物的輸血目前大都飼養活體犬和貓來滿足輸血的需求，血型的限制比較大，有成本高，操作復雜繁瑣的缺點。尋找安全有效的血液替代品成為世界范圍的研究熱點。豬血紅蛋白脂質體微囊動物人工紅細胞具有有效擴充血容量并向組織供氧、復蘇瀕臨死亡的寵物及珍稀動物的功能，在寵物醫學、奶牛業、良種畜禽治療及保護野生動物治療上具有廣泛應用前景。

由于血紅蛋白儲存期長、來源廣泛，因此以血紅蛋白為原料的血液代用品被廣泛研究。但是游離血紅蛋白能與NO結合,也能與血管收縮肽內皮素、巨噬細胞、白細胞和血小板作用,導致血管收縮，血壓升高；同時血紅蛋白被降解釋放鐵離子也能使細菌快速生長而造成敗血癥；血紅蛋白在血漿中易解聚為二聚體分子,在血漿循環中的半衰期僅為2-4h,且會產生強烈的腎毒性,導致腎功能下降。

一種經5-磷酸吡哆醛(PLP)交聯的血紅蛋白血液替代品再用戊二醛進行分子間關聯,形成大分子血紅蛋白,使血紅蛋白的半衰期延長。Sloan等在美國18個創傷中心對112例失血性休克患者進行了多中心、隨機、單盲的臨床試驗,有患者均多聚血紅蛋白或生理鹽水500毫升注入。其結果卻顯示血紅蛋白溶液組28d死亡率顯著高于對照組,雖然死亡率差異是否完全是由于直接的輸血或其他因素導致，還應當應進一步分析調查，這一結果限制了血紅蛋白溶液在臨床上的應用。Powanda研究表明交聯PolyHb-SOD-CAT的血紅蛋白，不會造成短暫性腦缺血再灌注模型缺血的組織損傷，也不會造成血腦屏障破壞或腦水腫。

為延長血紅蛋白的循環半衰期,通常還采用惰性分子如聚乙二醇修飾來增大相對分子質量,該血液替代品具有較長的血漿半衰期、低P50值和高粘度等特點。PEG可以保持Hb的氧結合部位的結構完整性,降低Hb免疫原性,提高血紅蛋白存留時間，減少過敏和免疫反應。聚乙二醇修飾的血紅蛋白，具有獨特的PEG-Hb的結合物分子特性，PEG-Hb的四聚體其結構和較高穩定性。PEG-Hb可以降低NO減少而導致的血壓升高，并增大血紅蛋白的分子質量防止血紅蛋白溢出到組織間隙。

重組血紅蛋白由基因工程生產而成，該制品可以解決Hb來源問題,不受輸血相關傳染病的影響,通過基因突變方法改變了Hb空間結構,使重組Hb不容易與NO結合，因此具有較好的前景。但由于目前技術水平的限制,重組Hb在細菌或真核細胞中表達率較低,產物分離純化困難等,因此造成Hb的純化費用過大,影響了該制品的商業化。

脂質體可以屏蔽無基質血紅蛋白的毒副作用，且延長血紅蛋白的血漿半衰期。Terajima等的研究也表明,通過檢測血流動力學、血液平均動脈血壓、中心靜脈壓，心臟指數值在液體休克復蘇時脂質體血紅蛋白可以保護微循環免受損傷。Sakai等的研究證明,在大鼠出血性休克模型復蘇實驗中,LEH對出血性休克的大鼠能迅速恢復血壓,并能顯著改善功能性毛細血管的密度和組織的氧合作用，脂質體血紅蛋白能正常保存1年以上。

發明內容

本發明的目的是提供一種動物通用人工紅細胞的制備方法。本發明方法無毒、收率高，得到的人工紅細胞大小均勻，適于應用，操作簡便，制備得到的人工紅細胞對于動物兔、貓、犬是安全的，無免疫原性，不會激活動物的正常免疫系統功能，輸血時不需要驗血型，可以直接使用節省搶救時間。

一種動物通用人工紅細胞的制備方法，包括以下步驟：

大豆卵磷脂和膽固醇按質量比例2:1充分溶于10-20ml乙醚中，再加入10ml提純的濃度范圍為100-250g/L的豬血紅蛋白溶液，將混合溶液加入旋轉蒸發儀中，轉速為90rpm,-0.1MPa至-0.01MPa減壓旋轉緩慢蒸發，水浴溫度為20-35℃，除去乙醚，再加入10ml生理鹽水洗滌，同時40KHZ水浴超聲振蕩5-10min，形成人工紅細胞；500rpm離心5min去除下層大顆粒人工紅細胞，取上液6000rpm離心5min，收集下層人工紅細胞，然后40KHZ探頭超聲5秒，停10秒，共10次，500rpm離心3-5min；取上液，收集人工紅細胞；所得的動物通用人工紅細胞直徑小于10微米。