[發(fā)明專利]間接免疫法糖化血清白蛋白檢測(cè)試劑盒及測(cè)定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210255292.4
• 申請(qǐng)日: 2012-07-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102914656A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王釗;趙艾鈞;譚韜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川省新成生物科技有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 成都行之專利代理事務(wù)所(普通合伙) 51220
• 代理人: 譚新民

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種間接免疫法糖化血清白蛋白檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

糖尿病（diabetes）是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各種致病因子作用于機(jī)體導(dǎo)致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合征，臨床上以高血糖為主要特點(diǎn)，典型病例可出現(xiàn)多尿、多飲、多食、消瘦等表現(xiàn)，即“三多一少”癥狀，糖尿病（血糖）一旦控制不好會(huì)引發(fā)并發(fā)癥，導(dǎo)致腎、眼、足等部位的衰竭病變，且無(wú)法治愈。

目前臨床常規(guī)檢查是檢測(cè)患者血糖濃度，但是血糖測(cè)定只能代表即刻的血糖水平，不能顯示一段時(shí)間內(nèi)血糖濃度的變化情況，因此不能作為評(píng)價(jià)疾病控制程度的指標(biāo)。

血液中的葡萄糖與白蛋白和其他蛋白分子N未端發(fā)生非酶促糖化反應(yīng)，形成糖化血清蛋白。由于血清中白蛋白的半衰期約21天，糖化血清蛋白測(cè)定可有效反映患者過(guò)去1～2周內(nèi)平均血糖水平，而且不受當(dāng)時(shí)血糖濃度的影響，是糖尿病病人評(píng)價(jià)疾病控制程度非常適宜的良好指標(biāo)。

較早測(cè)定糖化血清白蛋白（GA）的方法采用的是HPLC方法，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且不能滿足大規(guī)模臨床測(cè)定需求。

目前最主要的檢測(cè)糖化血清白蛋白（GA）的方法是由日本旭化成提供的酶法，該方法使用特定的蛋白水解酶切除血清白蛋白特殊的糖基化區(qū)域（Lys?525，參考文獻(xiàn)中白蛋白第525號(hào)位置的賴氨酸，同NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)最新白蛋白549號(hào)位的賴氨酸），后續(xù)再通過(guò)通用的生化顯色反應(yīng)測(cè)定被切除糖基化區(qū)域的多少，已達(dá)定量測(cè)定GA目的，同時(shí)使用通用生化白蛋白測(cè)定試劑測(cè)定血清白蛋白濃度，即可計(jì)算出糖化血清白蛋白比例，對(duì)臨床診斷提供參考。但是酶法在生化檢測(cè)中要抵抗膽紅素、脂濁、維生素C干擾，需要在試劑中添加大量干擾消除物質(zhì)（1-3%）以及對(duì)應(yīng)的多種保護(hù)劑（1-3%），不但使得試劑配方復(fù)雜化，會(huì)帶來(lái)意想不到的交叉干擾作用，同時(shí)大幅度提高試劑成本；而免疫法由于抗體所特有的特異性好優(yōu)點(diǎn)，以及檢測(cè)原理上的不同，上述物質(zhì)基本無(wú)干擾作用，僅需要添加極為微量（通用的是0.05%）的IEPS即可，甚至特異性最優(yōu)秀的抗體可不添加，因此試劑配方相對(duì)簡(jiǎn)單，交叉干擾作用微乎其微，成本也相對(duì)較低。

此外，歐洲專利#201187記載一種制備特異性抗糖化血紅蛋白單克隆抗體的方法；美國(guó)專利#522392記載了一種制備特異性抗糖化白蛋白單克隆抗體的方法；美國(guó)專利5470759記載另一種利用特異性抗糖化血紅蛋白單克隆抗體，建立免疫凝集試驗(yàn)和免疫濁度試驗(yàn)測(cè)定糖化血紅蛋白。在這些技術(shù)方案中，特異性的單克隆抗體都是針對(duì)糖化血紅蛋白或糖化白蛋白的糖化區(qū)域進(jìn)行特異性識(shí)別的。這些直接識(shí)別糖基化氨基酸區(qū)域的單抗目前是抗體制備難點(diǎn)，難以獲得抗體，試劑開(kāi)發(fā)以及推廣應(yīng)用受限。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種間接免疫法糖化血清白蛋白檢測(cè)試劑盒，該試劑盒區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)針對(duì)糖基化的糖化區(qū)域進(jìn)行特異性識(shí)別，采用特異性單克隆抗體高度特異性地識(shí)別非糖基化的特定糖基化區(qū)域，測(cè)定此特定位置非糖化血清白蛋白含量，該方案所用的單抗易于制備，并且成本較低，便于廣泛應(yīng)用和推廣。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：間接免疫法糖化血清白蛋白檢測(cè)試劑盒，包括針對(duì)血清白蛋白的糖基化區(qū)域制備的特異性單克隆抗體，該特異性單克隆抗體高度特異性地識(shí)別非糖基化的糖基化區(qū)域；還包括特異性識(shí)別糖基化區(qū)域的對(duì)位區(qū)域的單克隆抗體；由所述的特異性單克隆抗體和單克隆抗體制備成為免疫比濁試劑。

該技術(shù)方案中的“該特異性單克隆抗體高度特異性地識(shí)別非糖基化的糖基化區(qū)域”中，糖基化區(qū)域是指血液中的葡萄糖與白蛋白和其他蛋白分子N未端發(fā)生非酶促糖化反應(yīng)的區(qū)域，現(xiàn)有技術(shù)是針對(duì)糖基化的糖化區(qū)域進(jìn)行特異性識(shí)別，及識(shí)別的是糖化白蛋白中糖基化反應(yīng)之后的復(fù)合物；而本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的手段完全相反，采用識(shí)別非糖基化的特定糖基化區(qū)域特異性單克隆抗體，測(cè)定出該特定區(qū)域沒(méi)有進(jìn)行糖化反應(yīng)的白蛋白的濃度，再通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定總白蛋白濃度，用總白蛋白濃度減去沒(méi)有進(jìn)行糖化反應(yīng)的白蛋白的濃度即得到糖化白蛋白濃度。