[發明專利]脂環酸芽孢桿菌的間接ELISA檢測試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201210255219.7
• 申請日: 2012-07-23
• 公開（公告）號: CN102768276A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 劉磊;張亮;郭玉蓉
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C07K16/12;C07K16/06
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 高松

1.脂環酸芽孢桿菌的間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于，包括以下試劑：

（1）包被液：將1.59g?Na₂CO₃和2.93g?NaHCO₃加水充分溶解后，將pH調到9.6后，加去離子水定容為1L；

（2）PBS緩沖液：將準確稱量8g?NaCl、0.2g?KCl、1.42g?Na₂HPO₄和0.27g?KH₂PO₄充分溶液在800mL去離子水中，然后滴加HCl將pH值調節到7.4，然后加去離子水定容至1L；

（3）PBST洗滌液：向1L?PBS緩沖液中加入500μL?Tween-20；

（4）檢測抗體稀釋液：取10mL?37℃過夜培養的大腸桿菌菌液，12000rpm離心3min收集菌體，用PBS洗滌兩次后，加入3mL?PBS重懸菌體，超聲破碎30min，超聲5s、間隔5s；將超聲破碎后的液體在4℃，12000rpm離心30min，收集的上清為大腸桿菌裂解，即檢測抗體稀釋液；

（5）封閉液：1%牛血清白蛋白BSA；

（6）終止液：由10.87mL的濃硫酸與89.13mL的去離子水混合配制成的2M?H₂SO₄；

（7）包被抗原：菌體蛋白，濃度為20μg/mL；

（8）檢測抗體：脂環酸芽孢桿菌的兔抗血清，即脂環酸芽孢桿菌多克隆抗體，采用檢測抗體稀釋液稀釋，稀釋度為1:320；

（9）酶標二抗：辣根過氧化物酶HRP標記山羊抗兔IgG，采用PBS稀釋，稀釋度為1：10000；

（10）顯色液：TMB顯色液。

2.權利要求1的步驟（7）所述的包被抗原的制備方法，包括以下步驟：

將脂環酸芽孢桿菌接種到10mL的K氏培養液中，在220rpm，42℃條件下進行活化培養后，12,000rpm離心3min收集菌體，用PBS洗滌兩次，加入3mL的PBS重懸菌體，在冰浴條件下超聲破碎30min，其中超聲5s，間隔5s；將超聲破碎后的液體在4℃，12,000rpm離心30min，收集的上清即為包被抗原，并用紫外分光光度計測定上清液中總蛋白的濃度。

3.權利要求1的步驟（8）所述的脂環酸芽孢桿菌多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

（1）選取健康的雄性大白兔2只，適應一周后，進行免疫，其中一只注射制備的包被抗原，另一只注射PBS作為空白對照，

一免2周后進行二免，以后每隔一周免疫一次，一共免疫4次；第一次免疫時將免疫蛋白溶液與弗氏完全佐劑1:1的比例進行乳化，其他三次均為弗氏不完全佐劑，免疫方式為皮下多點注射；

（2）對于后期血清的大量采取選擇心臟采血，整個采血過程需要無菌操作；將采取的血樣放置于37℃溫箱1h，再放置于4℃中放置5h后1,500rpm離心30min，將上清用移液槍吸到另一個滅菌的離心管中，分裝后-20℃冰箱中保存備用。

4.根據權利要求1所述的脂環酸芽孢桿菌的間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述包被抗原的條件為4℃包被過夜或37℃包被2h。

5.根據權利要求1所述的脂環酸芽孢桿菌的間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述酶標二抗的工作條件為37℃孵育60min。

6.根據權利要求1所述的脂環酸芽孢桿菌的間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述脂環酸芽孢桿菌的間接ELISA檢測試劑盒在檢測底物時的反應時間為室溫條件下10min。

7.權利要求1、4、5、6任意一項所述脂環酸芽孢桿菌的間接ELISA檢測試劑盒在脂環酸芽孢桿菌檢測中的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

（1）從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，用包被液按1:10稀釋待測樣本，每孔加入100ul稀釋好的樣本，用封口膜封住反應孔，37℃溫箱孵育2小時；

（2）取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，加入后靜置2分鐘后扣除液體，重復操作3次，最后一次拍干；

（3）每孔加入100?ul封閉液，用封口膜封住反應孔，37℃溫箱孵育2小時；

（4）同步驟“2”；

（5）每孔加入100ul?1:320稀釋的檢測抗體，37℃溫箱孵育1小時；

（6）同步驟“2”；

（7）加入工作濃度的酶標二抗，每孔100?ul，用封口膜封口，37℃溫箱孵育1小時；

（8）取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，加入后靜置2分鐘后扣除液體，重復操作5次，最后一次拍干；

（9）加入顯色液TMB?100ul/孔，避光37℃孵箱，避光孵育15分鐘；

（10）加入終止液100ul/孔，混勻后即刻置于酶標儀中450nm測量每孔的OD；

（11）判斷標準：樣本OD值大于0.3?時判為陽性，小于0.2?時判為陰性，若處于0.2~0.3判為可疑；可疑樣品需要重復操作進行二次鑒定。