[發明專利]人類腸道病毒四色熒光RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201210251520.0
• 申請日: 2012-07-20
• 公開（公告）號: CN102851391A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 孫大為;周冬根;倪敏君;岑晨霞;陳麗;翟敏;曹雪春
• 申請（專利權）人: 寧波檢驗檢疫科學技術研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

1.一種人類腸道病毒四色熒光RT-PCR檢測試劑盒，包括多重熒光RT-PCR反應母液、AMV逆轉錄酶液、Taq?DNA聚合酶液、陽性對照品、陰性對照品，其特征在于：還包括內對照、所述的多重熒光RT-PCR反應母液包括多重10×PCR反應緩沖液、牛血清白蛋白及各上、下游引物及各特異性探針，其中所述的各上、下游引物序列、所述的特異性探針序列以及內對照序列如下：

腸道病毒EV71型上游引物EV71Pf如SEQ?ID?NO.1所示，5′-CGCAAATGCGTAGAAAGGT-3′；

腸道病毒EV71型下游引物EV71Pr如SEQ?ID?NO.2所示，5′-GGAGCAATTGTGGGACAACT-3′；

腸道病毒EV71型熒光探針EV71Pb如SEQ?ID?NO.3所示，

5′-FAM-AGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGC-BHQ1?-3′；

腸道病毒CoxA16型上游引物CoxA16Pf如SEQ?ID?NO.4所示，5′-?GAACCATCACTCCACACAGGAG-3′；

腸道病毒CoxA16型下游引物CoxA16Pr如SEQ?ID?NO.5所示，5′-?GTACCTGTGGTGGGCATTG-3′；

腸道病毒CoxA16型熒光探針CoxA16Pb如SEQ?ID?NO.6所示，

5′-HEX-?CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-BHQ1-?3′；

腸道病毒通用型上游引物EVPf如SEQ?ID?NO.7所示，5′-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3′；

腸道病毒通用型下游引物EVPr如SEQ?ID?NO.8所示，5′-GATTGTCACCATAAGCAGCCA-3′；

腸道病毒通用型熒光探針VPb如SEQ?ID?NO.9所示，

5′-ROX-AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQ1-?3′；

內對照序列如SEQ?ID?NO.10所示：

5′-GTGCTCACAC?CAGTTGCCGC?GGAAAGTATG?TGGAATGTTA?ACACACCCAC?ACCACACCCA?CACACGTGTT???GGATCAATTT??CGAGATGCGA??GCTGCCAAGC-3′；

內對照上游引物ICPf如SEQ?ID?NO.11所示，5′-?GATTAGTATGTCGGCTGCAGGTA?-3′；

內對照下游引物ICPr如SEQ?ID?NO.12所示，5′-?CAAGGCTCATAGCGCGTATC?-3′；

內對照熒光探針CPb如SEQ?ID?NO.13所示，5′-CY5-?CCGGTACATCCGACGGAGCGTC–BHQ2-3′。

2.根據權利要求1所述的人類腸道病毒四色熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的多重熒光RT-PCR反應母液配制如下：多重10×PCR反應緩沖液5ul；濃度20mg/ml的牛血清白蛋白1ul；濃度均為100μM的引物EVPf、EVPr、EV71Pf和EV71Pr各0.4ul；濃度均為100μM的引物CoxA16Pf和CoxA16Pr各0.5ul；濃度均為50μM探針EVPb、EV71Pb和CoxA16Pb各0.3ul；濃度均為100μM的引物ICPf和ICPr各0.2ul；濃度為50μM的探針ICPb?0.1ul；RNA酶DEPC水31.1ul，混合后于冰箱-20℃保存。

3.根據權利要求2所述的人類腸道病毒四色熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的多重10×PCR反應緩沖液組成為：三羥甲基氨基甲烷鹽酸終濃度為100mM、氯化鉀終濃度為500mM、甘油體積比為50%、四種單核苷酸單體終濃度為0.4mM，氯化鎂終濃度為3mM及相應體積的超純水。

4.根據權利要求1所述的人類腸道病毒四色熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述的陽性對照品為連接有設計腸道病毒通用型、EV71型、CoxA16型的引物、探針的基因保守序列的pUCm-T克隆載體；所述的陰性對照品為無RNA酶的DEPC水，所述的內對照為連接有內對照人工設計序列的pUCm-T克隆載體，所述的內對照的濃度為10⁴copies/ml。