[發明專利]一種一步法獲取豬OPN4基因的完整CDS區序列的方法

無效

• 申請號: 201210249708.1
• 申請日: 2012-07-19
• 公開（公告）號: CN102796742A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 鄒明峰;白林;康波;李學偉;帥素容;姜冬梅;朱礪;劉益平
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C12N15/70
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術，尤其涉及的是一種一步法獲取豬OPN4基因的完整CDS區序列的方法。

背景技術

OPN4(黑素視蛋白，Melanopsin)，近年發現的一種視網膜神經節細胞表達的感光視蛋白。是一個慢反應的綜合性的光色素，并充當晝夜變化的傳導分子。現已證實Melanopsin陽性的神經節細胞是哺乳動物中繼視錐、視桿細胞之外的第三種感光細胞，它可能與非脊椎動物體內的彈狀細胞源于一種共同的感光細胞，而Melanopsin的功能則是參與瞳孔對光反射、生物晝夜節律調節等非視覺成像系統，研究該基因的作用和功能將對動物感光機制以及生物節律的調控機制的進一步研究奠定基礎。

RT-PCR克隆：是將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)以及分子克隆相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的基因片段，將合成的目的基因片段克隆到載體細胞基因中，然后用質粒PCR產物測序。此技術利用PCR技術能在體外進行有效的基因擴增，而不需要內切酶消化和連接酶處理，可利用這一技術很快獲得其他依靠限制性內切酶消化的方法難于得到的PCR產物；克隆載體PCR測序能克服PCR產物測序引物近端的十幾個堿基無法測序獲得的缺點。與RACE(cNDA末端快速擴增)技術相比較而言，目的基因片段的長度明確，成本低，工作量小。該技術成功的關鍵是PCR引物的設計，在起始密碼子的上游設計上游引物，在終止密碼子的下游設計下游引物，使得PCR產物包含完整的基因編碼區全序列。

分段PCR克隆法：將目的基因分成幾段來分別克隆，然后做亞克隆測序拼接。成本高，工作量大耗時，一個基因分成幾段就需要做幾次克隆，然后再做序列接拼。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種一步法獲取豬OPN4基因的完整CDS區序列的方法。

本發明的技術方案如下：

一種克隆豬OPN4基因編碼區全序列的方法，包括以下步驟：

A1、提取豬視網膜組織中的總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA；

A2、引物的設計及PCR反應：以哺乳動物該基因的保守區作為模板在起始密碼子上游和終止密碼子的下游設計保守引物；設計的引物為：

上游引物P1：5′-atgaaccctccttcacggcc-3′

下游引物P2：5′-ctacatcctggggtccaggctg-3′

用cDNA為模板進行梯度PCR操作確定普通PCR的擴增條件，溫度為范圍在50℃到65℃之間的8個溫度點.PCR反應體系為10ul體系(5μL的2×Master?Mix?Tap，上下游引物各0.5μL，2μL的cDNA，2μL的ddH₂O.)，反應條件為95℃預變性5min，38個循環(94℃，30s；50℃，30s；72℃，60s)，最后72℃10min；

A3、PCR產物的回收和純化；

A4、克隆。

所述步驟A1包括以下步驟：用液氮將視網膜磨成粉末裝入1.5mE管，放入-80℃的超低溫冰箱中備用；取新的1.5ml的EP管，加入1ml的Trizol液，然后加入約80mg的視網膜組織粉末，用手搖晃混勻后，用震蕩儀震蕩約30秒后室溫放置5分鐘；加入0.2ml的氯仿，蓋緊離心管，4℃下13000rpm離心8分鐘，取上層水相于一新的離心管，加入等體積的異丙醇，室溫放置5分鐘，4℃下12000rpm離心10分鐘；棄去上清液，加入1ml的75％乙醇混勻，4℃下7500g離心5分鐘；小心棄去上清液，然后用移液槍吸干管壁上多余的乙醇，加入30ul到100ul的DEPC水；瓊脂糖凝膠檢測RNA的質量，將效果好的RNA立即反轉錄成cDNA。

所述的方法，所述步驟A3包括以下步驟：

a.將60μl?PCR產物于1％的瓊脂糖凝膠中電泳。用干凈的手術刀割下所要回收的DNA的瓊脂塊，放入1.5ml離心管稱取重量。

b.按每0.1克膠塊加入300μl溶膠液；于50℃水浴放置10分鐘，其間不斷溫和地上下翻轉EP管，以確定膠塊充分溶解；

c.溶解后的凝膠溶液加入吸附柱中，吸附柱放入收集管中，12000r/min離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中；

d.向吸附柱加入700μl漂洗液PW，12000r/min離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中；