[發明專利]一種耐酸性高溫α-淀粉酶及其基因、工程菌和制備方法

有效

• 申請號: 201210246909.6
• 申請日: 2012-07-17
• 公開（公告）號: CN102787130A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 劉逸寒;路福平;樊帥;徐艷靜;胡博;王春霞;王建玲
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/10;C12N1/21;C12N9/28;C12R1/125;C12R1/10
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 王來佳

技術領域

本發明屬于生物工程領域，涉及基因的定點突變和重組DNA技術，尤其是一種耐酸性高溫α-淀粉酶及其基因、工程菌和制備方法。

背景技術

α-淀粉酶(α-1,4-glucan-4-glucanohyddrolase?EC?3.2.1.1)能夠以淀粉為底物，從淀粉內部水解α-1,4葡萄糖苷鍵，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖。淀粉在α-淀粉酶的作用下，分離迅速降解，粘度下降，即完成液化。α-淀粉酶可由微生物發酵產生，也可由植物、動物提取。目前工業生產上大都以微生物發酵大規模生產α-淀粉酶。枯草桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、米曲霉、黑曲霉等都是具有使用價值的α-淀粉酶產生菌，其中地衣芽孢桿菌生產的α-淀粉酶因具有熱穩定性而被優選使用。耐高溫的α-淀粉酶由于具有相當高的熱穩定性，因此自從1973年開始投入生產以來，可被廣泛應用于制糖、釀造、有機酸等以淀粉為原料的深加工工業，是目前工業上用途最為廣泛的酶種之一。

在實際生產中，淀粉經糊化后的自然pH常常在4.5左右，但一般α-淀粉酶最適pH為6.5，所以液化前需加要堿提高pH值。目前，國內外使用量最大的來源于黑曲霉的糖化酶最適pH為4.3-4.8，這就要求淀粉液化后，在進行糖化酶糖化前，必須再將pH值調回到4.5左右。且液化中低pH條件有利于減少影響糖液質量的糠醛、氨基葡萄糖等色素物質的形成，提高糖液質量。同時，pH的反復調節既增加了操作步驟，也增大了化學試劑的消耗，需要在最后的終產物處理中利用離子交換將多余的鹽分除去。為了給淀粉原料深加工提供更好地工藝條件，提高產品質量和收得率、降低消耗、增加效益、特別是節約工業用糧，開發一種耐酸性高溫α-淀粉酶，從而滿足一些在酸性條件下進行淀粉原料液化工藝的要求，就顯得勢在必行。

目前，研究者主要通過菌種選育和基因工程手段，改善耐高溫α-淀粉酶。德國Nielsen經定點突變后獲得地衣芽孢桿菌耐高溫α-淀粉酶突變體Y290E，在酸性條件下活力提高，但耐熱性能降低。美國Richardson從各地深海及酸性土壤環境微生物構建的宏基因組文庫中篩選得到三個α-淀粉酶突變體，BD5031及BD5064表現出高活性但并不耐酸或者耐高溫，BD5063耐酸耐高溫但是活性很低。印度Priyadharshini對部分地衣芽孢桿菌耐高溫α-淀粉酶氨基酸序列進行隨機突變，獲得一個pH適用范圍變寬的突變體I57S/W193R，但其催化活性及耐熱性能均顯著降低。

在我國，20世紀90年代中科院微生物研究所研究了嗜熱真菌Thermomyces?lanuginosus所產的α-淀粉酶，該酶的最適溫度和pH分別為65℃和5.0，但其耐熱性較差。目前商品化應用的真菌Aspergillus?oryzae和Aspergillus?awamori所產α-淀粉酶pH范圍為5.0-6.0，但不耐高溫。江南大學從淀粉加工廠的酸性土壤中篩選到的Bacillus?stearothermopilius，能夠產生兩種酸性α-淀粉酶，最適pH分別為4.5和5.0，最適溫度為60℃，可以應用于一定條件下酒糟利用和處理。

目前α-淀粉酶難以兼顧耐高溫、耐酸性及高活力的特性，因此不能適應我國制糖、釀造、有機酸等以淀粉為原料的深加工工業的要求。為了適應整個淀粉加工行業的需要，滿足一些在酸性條件下以淀粉為原料液化工藝的要求，應開發一種在高溫、低pH值下活力穩定的耐酸性高溫α-淀粉酶。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種耐酸性高溫α-淀粉酶及其基因、工程菌和制備方法，本發明制備獲得的該耐酸性高溫α-淀粉酶具有良好的酸穩定性，在pH4.5，90℃下保溫60min殘余活力仍保持在40%以上。

本發明實現目的的技術方案如下：

一種耐酸性高溫α-淀粉酶基因，其基因序列為序列8。

一種耐酸性高溫α-淀粉酶基因的構建方法，方法為：將耐高溫α-淀粉酶基因進行定點突變，第1058位堿基C→T，第1199位堿基A→G，得到耐酸性高溫α-淀粉酶基因；所述耐高溫α-淀粉酶基因見序列7。

一種耐酸性高溫α-淀粉酶工程菌，含有如權利要求1所述的耐酸性高溫α-淀粉酶基因。

而且，所述工程菌的宿主細胞為枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。

而且，所述工程菌為6種胞外蛋白酶缺失的枯草芽孢桿菌B.subtilis?WB600。

而且，所述工程菌中的表達載體為大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質粒pBSA43。

一種耐酸性高溫α-淀粉酶，具有如權利要求1所述的基因編碼的蛋白序列。