[發明專利]線粒體數目減少的人支氣管上皮細胞株的建立和鑒定技術

有效

• 申請號: 201210246077.8
• 申請日: 2012-07-17
• 公開（公告）號: CN103255100A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 李冰燕;童建;尉紅;薛蓮
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/68
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 曹毅

技術領域

?本發明涉及生物技術領域，具體的說，是一種線粒體數目減少的人支氣管上皮細胞株的建立和鑒定技術。

背景技術

作為細胞代謝網絡和信號傳導網絡的重要調控細胞器，線粒體在生長、發育、代謝、衰老、疾病、死亡等多個方面表現出重要作用。大量的流行病學資料表明，mtDNA突變或拷貝數異常與多個系統、多種疾病的發生密切相關，如線粒體腦肌病、Léger遺傳性視神經病、神經退行性疾病、腫瘤、心肌病、糖尿病、先天性失明等。統計學數據顯示，0.092%的成年人患有臨床線粒體性疾病，0.165%的兒童和成年人易患線粒體性疾病。

發明內容

本發明的目的在于發明一種線粒體數目減少的人支氣管上皮細胞株的建立和鑒定技術，為更好地了解線粒體數與疾病發病關系提供細胞研究模型，加快線粒體疾病的研究。

為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現：

線粒體數目減少的人支氣管上皮細胞株的建立和鑒定技術，包括以下步驟：

a．線粒體數目減少的人支氣管上皮細胞株的建立

步驟1：將永生化人支氣管上皮細胞常規培養在37℃含有5%二氧化碳的培養箱中，使用線粒體敲除誘導培養基培養9天，2至3天更換一次所述線粒體敲除誘導培養基；?

步驟2：使用線粒體拷貝數減少的維持培養基繼續培養所述永生化人支氣管上皮細胞30天，2至3天更換一次所述線粒體拷貝數減少的維持培養基；?

b．real?time?quantitative?PCR檢測所述永生化人支氣管上皮細胞中線粒體拷貝數

步驟1：參照細胞全基因組提取試劑盒的操作說明,所述永生化人支氣管上皮細胞經胰酶消化，離心后收集,提取所述永生化人支氣管上皮細胞全基因組DNA，紫外分光光度計測定吸光度A260、A280值，確定DNA純度及含量；

步驟2：采用mtDNA編碼的16S和ND1擴增mtDNA，核基因編碼的18S擴增nDNA?,以GAPDH作內參基因；

步驟3：建立25μl的PCR反應體系，其中2μl?的DNA，?0.5μM?正反引物各1μl，12.5μl?2×?SYBR?green?PCR?Master?Mix，8.5μl。每個樣品設6個復孔，其中3個孔擴增nDNA，3個孔擴增mtDNA。Real-time?PCR的循環參數：預變性95℃?10?min；變性95℃?15s，復性60℃?1?min，延伸72℃?1min，共40個循環；最后72℃延伸10?min。擴增結束后軟件分析計算DNA相對表達量。使用7500Real-Time?PCR?System?的分析軟件，將所述永生化人支氣管上皮對照組細胞ND1/18S或16S/18S的比值設定為1，利用Comparative?C_T方法計算EB處理后所述永生化人支氣管上皮細胞的mtDNA相對拷貝數。

????進一步的，常規培養基成分為：4.5?g/L的高糖DMEM培養基，10%?FBS，100?IU/ml?青霉素，100μ?g/ml?鏈霉，所述線粒體敲除誘導培養基是在所述常規培養基中加50?ng/ml?EB，100?μg/ml丙酮酸鈉、50?μg/ml尿嘧啶合成，所述線粒體拷貝數減少的維持培養基是在所述常規培養基中加12.5?ng/ml?EB，100?μg/ml丙酮酸鈉、50?μg/ml尿嘧啶合成。

????與現有技術相比，本發明具有以下優點：

本發明提供了一種線粒體數目減少的人支氣管上皮細胞株的建立和鑒定技術，為更好地了解線粒體數與疾病發病關系提供了較好的細胞研究模型，對于闡明線粒體疾病的發病機制、減緩線粒體疾病的進展及阻斷繼發損害具有重要意義。

上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例詳細說明如后。

具體實施方式

下面將結合實施例，來詳細說明本發明。

????線粒體數目減少的人支氣管上皮細胞株的建立和鑒定技術，細胞系為永生化人支氣管上皮細胞。

????常規培養基成分：4.5?g/L的高糖DMEM培養基，10%?FBS，100?IU/ml?青霉素，100?μg/ml?鏈霉。

????線粒體敲除誘導培養基是在所述常規培養基中加50?ng/ml?EB，100?μg/ml丙酮酸鈉、50?μg/ml尿嘧啶合成。