[發(fā)明專利]線粒體數(shù)目減少的人支氣管上皮細(xì)胞株的建立和鑒定技術(shù)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210246077.8
• 申請日: 2012-07-17
• 公開（公告）號(hào): CN103255100A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李冰燕;童建;尉紅;薛蓮
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12Q1/68
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 曹毅

1.線粒體數(shù)目減少的人支氣管上皮細(xì)胞株的建立和鑒定技術(shù)，其特征在于，包括以下步驟：

a．線粒體數(shù)目減少的人支氣管上皮細(xì)胞株的建立

步驟1：將永生化人支氣管上皮細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在37℃含有5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中，使用線粒體敲除誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)9天，2至3天更換一次所述線粒體敲除誘導(dǎo)培養(yǎng)基；?

步驟2：使用線粒體拷貝數(shù)減少的維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)所述永生化人支氣管上皮細(xì)胞30天，2至3天更換一次所述線粒體拷貝數(shù)減少的維持培養(yǎng)基；?

b．real?time?quantitative?PCR檢測所述永生化人支氣管上皮細(xì)胞中線粒體拷貝數(shù)

步驟1：參照細(xì)胞全基因組提取試劑盒的操作說明,所述永生化人支氣管上皮細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心后收集,?提取所述永生化人支氣管上皮細(xì)胞全基因組DNA，紫外分光光度計(jì)測定吸光度A260、A280值，確定DNA純度及含量；

步驟2：采用mtDNA編碼的16S和ND1擴(kuò)增mtDNA，核基因編碼的18S擴(kuò)增nDNA?,以GAPDH作內(nèi)參基因；

步驟3：建立25μl的PCR反應(yīng)體系，其中2μl?的DNA，?0.5μM?正反引物各1μl，12.5μl?2×?SYBR?green?PCR?Master?Mix，8.5μl，每個(gè)樣品設(shè)6個(gè)復(fù)孔，其中3個(gè)孔擴(kuò)增nDNA，3個(gè)孔擴(kuò)增mtDNA，Real-time?PCR的循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95℃?10?min;變性95℃?15s，復(fù)性60℃?1min，延伸72℃?1min，共40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10?min，擴(kuò)增結(jié)束后軟件分析計(jì)算DNA相對表達(dá)量，使用7500?Real-Time?PCR?System?的分析軟件，將所述永生化人支氣管上皮對照組細(xì)胞ND1/18S或16S/18S的比值設(shè)定為1，利用Comparative?C_T方法計(jì)算EB處理后所述永生化人支氣管上皮細(xì)胞的mtDNA相對拷貝數(shù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的線粒體數(shù)目減少的人支氣管上皮細(xì)胞株的建立和鑒定技術(shù)，其特征在于：常規(guī)培養(yǎng)基成分為：4.5?g/L的高糖DMEM培養(yǎng)基，10%?FBS，100?IU/ml?青霉素，100μ?g/ml?鏈霉，所述線粒體敲除誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在所述常規(guī)培養(yǎng)基中加50?ng/ml?EB，100?μg/ml丙酮酸鈉、50?μg/ml尿嘧啶合成，所述線粒體拷貝數(shù)減少的維持培養(yǎng)基是在所述常規(guī)培養(yǎng)基中加12.5?ng/ml?EB，100?μg/ml丙酮酸鈉、50?μg/ml尿嘧啶合成。