[發明專利]檢測李痘病毒的膠體金免疫試紙條及檢測方法

無效

• 申請號: 201210245860.2
• 申請日: 2012-07-12
• 公開（公告）號: CN103048451A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 陳定虎;王勇;楊雷亮;劉恭源;劉軍
• 申請（專利權）人: 陳定虎
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12N15/40;C12N15/70;C07K14/08;C07K16/10;C07K16/06
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技術領域

本發明涉及一種檢測李痘病毒的膠體金免疫試紙條，本發明還涉及一種采用該膠體金免疫試紙條檢測李痘病毒的方法。

背景技術

李痘病毒(Plumpoxvirus，PPV)是我國頒布的最新檢疫性病原物，屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)中的馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)，它是核果類果樹危險性最大的病毒之一(Dunez，Sutic，1988；Nemeth，1994)，其自然寄主主要是李屬的木本植物，如杏(PrunusarmeniacaL.)、桃(P.persicaL.)和歐洲及日本的李子(P.domesticaL.和P.salicinaLindl.)以及甜櫻桃(P.aviumL.)和酸櫻1桃(P.cerasusL.)等。果樹一旦受其侵染，則葉片扭曲褪綠，葉脈黃化，特別是果實變形變小，出現花斑，造成品質下降，未成熟果實大量脫落，使產量嚴重降低，而且其傳播速度快，在短時間內即可能給果樹業的發展帶來災難性損失。

廣東地處我國的南方開放地區，地理環境優越，每年經過廣東轄區口岸的進出境種子，花卉，苗木等容易攜帶病毒的材料約占我國總數量的一半，由于進出境批次多，數量龐大，急需研究出即能保證一定的檢測數量，又能夠檢測速度快，而且靈敏度要高，成本也不太昂貴的檢測方法。雖然目前在口岸對果樹病毒病檢測仍然以酶聯免疫吸附法(ELISA)為主，但是ELISA需要專門的儀器設備，而且需要有專業人員才可以進行檢測判定，操作繁瑣，所需時間也比較長，急需更為簡單快速靈敏的檢測方法才能更加適合口岸快檢快放的要求。

目前國外國內，植物病毒的檢測方法主要有如下5種：一是傳統的生物學方法，其特點是周期長，準確度低，檢測病毒數量少，勞動強度大，；二是電子顯微鏡方法，但它只能觀察病毒粒體形態，不能鑒定病毒種類，而且操作復雜，價格十分昂貴；三是酶聯免疫吸附分析法，是目前應用最廣的病毒檢測方法，但其檢測時間長，操作步驟多，而且需要專用儀器和購買昂貴的特異性抗血清；四是PCR方法雖然靈敏度非常高且快速，但更需要專用儀器和專業人員，而且檢測通量有限；五是基因芯片檢測技術，它是目前最有發展前途和潛力的檢測方法，但其檢測結果的穩定性和重復性還有必要進一步完善，而且儀器價格也是十分昂貴，操作復雜，檢測時間也長。

因此，非常有必要在上述5種方法之外再研究新的檢測方法，以便充分滿足一線口岸植物種苗病毒快速檢測的需要。

發明內容

本發明的目的是為了克服現有技術中的不足之處，提供一種使用方便，能快速檢測李痘病毒的膠體金免疫試紙條。

本發明另一個目的是提供一種采用該膠體金免疫試紙條檢測李痘病毒的方法。

為了達到上述目的，本發明采用以下方案：

一種檢測李痘病毒的膠體金免疫試紙條，其特征在于按以下步驟制備：

A、從李痘病毒感病材料中提取李痘病毒的RNA；

B、用RT-PCR的方法克隆李痘病毒的外殼蛋白基因，然后將其連接到原核表達載體pET29(a)上，得到pET29a-PPV重組載體，以序列測定最終驗證閱讀框架正確的重組質粒，用以李痘病毒外殼蛋白基因的誘導表達；將pET29a-PPV重組載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)；

C、用親和柱法回收特異性表達蛋白，再免疫家兔，獲得李痘病毒抗血清；

D、采用上述抗血清制備出檢測李痘病毒的膠體金免疫試紙條。

如上所述的檢測李痘病毒的膠體金免疫試紙條，其特征在于步驟A中從李痘病毒感病材料中提取李痘病毒的RNA具體包括以下步驟：

(1)李痘病毒感病材料的幼嫩組織若干，液氮研磨，分裝成＜100mg小份至預冷E.P.管，100mg樣品加入1mLTriZOL抽提；

(2)12000rpm，2-8℃離心10min；

(3)吸取上清液，轉移至新的1.5mLE.P.管中，15-30℃放置5min；

(4)加0.2mL氯仿，充分抽提8min，15-30℃放置2-3min；

(5)12000rpm、2-8℃離心15min；

(6)吸取上清液，轉移至新的1.5mLE.P.管中，加0.5mL異丙醇，15-30℃放置10min；

(7)12000rpm、2-8℃離心10min；

(8)棄去上清液，得膠體狀RNA，加1-1.5mL75％乙醇，渦旋混勻；

(9)7500rpm、2-8℃離心5min，棄去上清，留下膠體狀RNA；

(10)干燥5-10min；