[發明專利]一種端基為熒光基團芘的水溶性陽離子聚電解質及其制備方法及應用

有效

• 申請號: 201210245819.5
• 申請日: 2012-07-16
• 公開（公告）號: CN103012639A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 王國杰;趙敏;楊領葉;張瑞辰
• 申請（專利權）人: 北京科技大學
• 主分類號: C08F120/34
• 分類號: C08F120/34;C08F8/44;C09K11/06;C07C213/08;C07C219/06;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 皋吉甫

1.一種端基為熒光基團芘的水溶性陽離子聚電解質的制備方法，所述的方法步驟包括：

(1)合成原子轉移自由基聚合引發劑的溴代反應：

將芘甲醇溶于干燥THF和三乙胺，并置于反應容器中，冰水浴中冷卻到0-5攝氏度；逐滴加入1-2當量的2-溴-異丁酰溴和四氫呋喃的混合溶液，在室溫下回流反應8個小時；反應完成后，兩次抽濾掉不溶物溴胺鹽，旋蒸除去大部分的四氫呋喃溶劑，剩余物質用二氯甲烷稀釋，并用飽和碳酸鉀溶液萃取，有機相通過無水硫酸鎂干燥過濾后旋蒸得到粗產物，用無水甲醇重結晶，真空干燥得淡黃色固體；

(2)采用原子轉移自由基聚合制備端基為熒光基團芘的聚（甲基）丙烯酸二甲氨乙酯：

將步驟(1)中得到的原子轉移自由基聚合引發劑置于四氫呋喃溶劑中；再加入催化劑,配位劑，聚合單體，在70攝氏度下進行原子轉移自由基聚合1.5小時，用中性氧化鋁柱層析提純，旋蒸除去溶劑，并用冷正己烷沉淀，真空干燥得白色固體；

(3)端基為熒光基團芘的聚（甲基）丙烯酸二甲氨乙酯的季銨鹽反應：

將步驟(2)中得到的端基為芘熒光基團的聚（甲基）丙烯酸二甲氨乙酯置于乙醇溶劑中，逐滴加入6當量的季胺化小分子，在85攝氏度下回流反應24個小時；用四氫呋喃沉淀出產物，并索氏提取12個小時，四氫呋喃作提取劑，真空干燥得白色固體。

2.按照權利要求1所述端基為芘熒光基團的新型水溶性陽離子聚電解質的制備方法，其特征在于：所述步驟（2）中，所用的聚合單體為丙烯酸芘甲酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯或它們的任意混合物。

3.按照權利要求1所述端基為芘熒光基團的新型水溶性陽離子聚電解質的制備方法，其特征在于：所述步驟（2）中，聚合所用的催化劑為氯化亞銅、溴化亞銅或是碘化亞銅；所用的配位劑為1,1,4,7,10,10-六甲基三亞乙基四胺或是N,N,N,N,N-五甲基二亞乙基三胺。

4.按照權利要求1所述端基為芘熒光基團的新型水溶性陽離子聚電解質的制備方法，其特征在于：所述步驟（3）中，所用的季胺化小分子為鹵代烷烴包括溴代丁烷、碘甲烷。

5.根據權利要求1所述方法制備的一種端基為熒光基團芘的水溶性陽離子聚電解質，其結構通式如下：

其中n代表聚電解質的重復單元數，為1～500之間的整數。R₁=H，CH₃；R₂=CH₃,CH₂CH₃,CH₂CH₂CH₃,CH₂CH₂CH₂CH₃；X₁=Cl,I,Br；X₂=I,Br。

6.利用權利要求5所述的端基為芘熒光基團的新型水溶性陽離子聚電解質的特異性識別核酸分子堿基序列結構的應用方法，所述方法步驟如下：

(1)用磷酸鹽緩沖溶液將端基為熒光基團芘的水溶性陽離子聚電解質配置成10^-4mol/L的稀溶液；

(2)將冷凍儲存的不同種類的DNA引物離心后溶解在適量磷酸鹽緩沖溶液配置成DNA稀溶液。所述的DNA引物種類及堿基序列如下：

DNA1—發夾結構DNA(GCA?CAA?ACA?AGT?AGA?ATG?TAT?GTG?C)；

DNA2—與DNA?1互補的直鏈DNA(GCA?CAT?ACA?TTC?TAC?TTG)；

DNA3—與DNA?2互補的直鏈DNA(GCA?CAT?ACA?TTC?TAC?TTG)；

DNAa—堿基全是A的直鏈DNA(AAA?AAA?AAA?AAA?AAA?AAA)；

DNAc—堿基全是C的直鏈DNA(CCC?CCC?CCC?CCC?CCC?CCC)；

DNAt—堿基全是T的直鏈DNA(TTT?TTT?TTT?TTT?TTT?TTT)；

(3)取適量聚電解質溶液、適量不同類型的DNA引物溶液和磷酸鹽緩沖液混配成樣品溶液。所述的樣品溶液可分為兩個系列：

系列a：（聚電解質和發夾結構DNA）聚電解質、聚電解質+DNA1、聚電解質+DNA1+DNA2、聚電解質+DNA1+DNAa、聚電解質+DNA1+DNAc和聚電解質+DNA1+DNAt樣品溶液；

系列b：（聚電解質和直鏈結構DNA）聚電解質、聚電解質+DNA2、聚電解質+DNA2+DNA3、聚電解質+DNA2+DNAa、聚電解質+DNA2+DNAc和聚電解質+DNA2+DNAt樣品溶液；

(4)對樣品溶液進行加熱處理：80攝氏度下加熱10分鐘后自然冷卻到室溫，測定樣品溶液的熒光發射光譜。根據熒光強度變化來識別靶向DNA的堿基序列。其中所用到的狹縫寬度是2.5nm，激發波長是344nm；

(5)將DNA1和DNA2互補的DNA雙鏈溶液1、DNA2和DNA3互補的DNA雙鏈溶液2和聚電解質分別與DNA1和DNA2互補的DNA雙鏈及DNA2和DNA3互補的DNA雙鏈混配得到混合溶液3和4進行如步驟（4）所屬的加熱處理，然后測定4種溶液的圓二色譜；

(6)向步驟(3)混配得到的系列a和系列b樣品溶液中分別加入適量碘化鉀溶液，并在波長為344nm的光激發下，測得各混合溶液的熒光發射光譜，得到不同樣品溶液的熒光淬滅效率。