[發明專利]使用聚多卡醇和衍生物的核酸分離

有效

• 申請號: 201210241968.4
• 申請日: 2007-12-10
• 公開（公告）號: CN102776173A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: S·阿迪;H·勒英;N·納克鮑爾;E·魯斯曼
• 申請（專利權）人: 霍夫曼-拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/70
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 柯珂;萬雪松

本案是申請號為200710199513.X的中國專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及一種組合物，所述組合物包含離液劑、緩沖物質和0.5％～5％(V/V)的聚多卡醇或其衍生物。本發明也涉及所述組合物的用途和包括本發明的組合物的試劑盒。本發明還涉及用于在生物樣品中檢測核酸的方法，所述方法包括下列步驟：在離液劑、緩沖物質和0.5％～5％(V/V)的聚多卡醇或其衍生物的存在下培養所述生物樣品，任選地分離所述核酸，任選地擴增所述核酸，以及檢測所述核酸。本發明進一步涉及用于在生物樣品中提純核酸的方法，所述方法包括下列步驟：在離液劑、緩沖物質和0.5％～5％(V/V)的聚多卡醇或其衍生物的存在下培養所述生物樣品，和分離所述核酸由此提純所述核酸。

背景技術

許多生物物質，尤其是核酸，就將它們與其自然環境分離而言提出了特殊的挑戰。一方面，核酸常常以極低的濃度存在，另一方面，它們常常在存在許多其他固體和溶解物，如溶胞后的細胞的情況下被發現。這導致核酸難以分離或測定，尤其是在生物特異性測定中，所述生物特異性測定允許對特定分析物，如核酸進行檢測，或對特定分析物性質進行檢測，而且在診斷及生物分析學領域的研究與發展中起主要作用。生物特異性測定的實例是雜交測定、免疫測定和受體-配體測定。雜交測定使用用于核酸分析物，如RNA和DNA的分子檢測的特異性堿基配對。因此，長度為18～20個核苷酸的寡核苷酸探針能夠對例如人類基因組中的所選的互補序列進行特異性識別。需要兩個寡核苷酸引物選擇性結合的另一種測定是在US?4,683,195中描述的聚合酶鏈反應(PCR)。該方法允許通過具有熱穩定性的聚合酶在脫氧核苷三磷酸的存在下在幾個循環中將特定的核酸區域選擇性擴增至可檢測的水平。

如上所述，在上面所提及的測定之一中分析所述生物物質或將其用于其他過程中之前，必須從包含不同成分例如蛋白質成分和非蛋白質成分的復雜混合物的生物樣品中將其分離或提純。對于第一階段的步驟來說，常常使用可允許所關注的成分如核酸富集的方法。這些常常包含在細菌細胞、真菌細胞、病毒顆粒或更為復雜的有機體的細胞如人類血細胞或植物細胞中。所關注的成分也被稱為“靶標成分”。

為釋放所述細胞或顆粒的內容物，所述細胞或顆粒可以用酶或化學藥品進行處理從而使有機體的細胞壁溶解、降解或變性。該過程通常稱為溶胞(lysis)。包含該胞溶物的所得溶液稱為溶胞產物。在溶胞過程中常常遇到的問題是降解所述靶標成分的其他酶(如分解核酸的脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶)在溶胞過程中與所關注的成分接觸。這些降解酶也可存在于所述細胞的外部，或在溶胞前以不同的細胞區室在空間上分隔開再與靶標成分接觸。在該過程中釋放的其他成分可以為例如屬于脂多糖的內毒素，其對細胞具有毒性并可能導致意圖用于人類或動物療法的產品出現問題。

已經有各種手段可以解決上面所提及的該問題。當意欲釋放核酸時通常使用諸如硫氰酸胍或陰離子、陽離子、兩性離子或非離子洗滌劑等離液劑。此外有利的是使用可快速降解這些酶或不需要的蛋白的蛋白酶。然而，這有可能導致另一個問題，即所述物質或酶在后續步驟中會干擾各試劑或成分。

可有利地用于上述溶胞或樣品制備過程的酶是可使蛋白質底物中的酰胺鍵分裂并被分類為蛋白酶，或(可以替代地)肽酶的酶(參見Walsh，C.，Enzymatic?Reaction?Mechanisms(1979)chapter?3，W.H.Freeman?and?Company，San?Francisco)。已經得到應用的蛋白酶是例如堿性蛋白酶(WO?98/04730)或酸性蛋白酶(US?5,386,024)。廣泛用于核酸分離的樣品制備的蛋白酶是來自Tritirachium?album的蛋白酶K(例如參見Sambrook，J.，等：Molecular?Cloning(1989)Cold?Spring?Harbor?University?Press，NY，USA)，該蛋白在酶pH約為中性時具有活性并屬于本領域的技術人員所公知為枯草桿菌蛋白酶(subtilisins)的蛋白酶族。枯草桿菌蛋白酶是由革蘭氏陽性細菌或真菌所產生的絲氨酸蛋白酶。

在溶胞步驟之后的樣品制備的后續步驟中，所述靶標成分被進一步富集。如果所述靶標成分是核酸，則該靶核酸通常在其用于基于探針的測定之前由復雜溶胞混合物提取。

對于核酸的提取已經有了數種方法：

-序列依賴性或生物特異性方法，如：

-親合色譜法

-與固定化探針雜交

-不依賴序列的或物理化學方法，如：