[發明專利]一種快速篩選和制備香料的方法

有效

• 申請號: 201210239109.1
• 申請日: 2012-07-12
• 公開（公告）號: CN102732593A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 楊葉昆;李雪梅;米其利;夭建華;魏玉玲;徐濟倉;陳建華
• 申請（專利權）人: 云南煙草科學研究院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

技術領域：

本發明涉及一種快速篩選和制備香料的方法，特別是涉及一種基于細胞毒性檢測技術及提取分離技術快速篩選和制備安全的香料的方法。屬香料的研究與開發領域。?

背景技術：

食用香料有1700種以上，是食品添加劑中最大的家族，其中，約有1300種是從人類普遍食用的香料植物中提取出的天然物質，在特殊或普遍的地區有安全的食用歷史。由于這些物質的使用量較小且揮發性較強，很難對人體造成損害，因而大多數的天然食用香料都被認為是安全的（GRAS類物質）。人們在食品中大量使用這些物質而沒有考慮其安全性，事實上，這類香料的毒性特別是慢性毒性沒有被很好地研究。例如，將黃樟素（Safrole）用作香料添加劑已有60多年的歷史。美國FDA發現無論是從黃樟中提取的，還是來自化學合成的黃樟素都可使大鼠患肝瘤。所以對香料的安全性評價研究非常必要。?

毒理學安全性評價的第一步工作是急性毒性試驗，經典的急性經口毒性試驗雖然可較精確的測量LD50值，但以死亡為觀察終點。一般需耗用40-80只動物(大鼠或小鼠等)?，?觀察時間至少為14d。隨著近年3R原則(減少Reduction，優化Refinement，替代?Replacement?)的提出和人類對動物福利的關注，以動物模式為基礎的毒理學安全性評價系統和方法逐漸受到挑戰。以體外毒理學測試技術代替整體動物的毒理學安全性評價是當今毒理學測試方法發展的趨勢。?

檢測化學品細胞毒性的常用方法有中性紅攝入法和MTT法。中性紅攝入法細胞毒性試驗的原理是：中性紅(neutral?red)?一種陽離子活性染料，以離子擴散方式進人細胞膜并與溶酶體基質的陰離子部分結合。中性紅染料的攝入、轉運和貯存依賴于活性生物過程，需要能量、完整溶酶體。這些系統中的任何損傷，或者由于細胞死亡導致的細胞數減少意味著中性紅攝入減少，正常生長的細胞具有攝取中性紅的能力，當細胞膜和溶酶體膜中毒損傷時就會導致中性紅的進人下降。細胞中性紅的攝入量與活細胞數量成正比。?

中性紅細胞毒性試驗不使用動物，試驗周期為3天，有效的減少了動物的使用量及縮短了試驗周期，且該試驗較靈敏準確、結果穩定、操作簡便、重復性好，是檢測細胞?毒性常用的方法。?故本發明采用中國倉鼠卵巢細胞（Chinese?Hamster?Ovary?Cell，簡稱CHO細胞）的中性紅攝入試驗來篩選和制備安全性香料，用于香料的細胞毒性的快速初步研判，了解香料初提物的安全性；并在其指導下，通過現代提取分離技術，最終制備得到安全可用的香料。?

發明內容：

本發明的目的在于克服現有技術之不足，而提供一種快速篩選和制備香料的方法。

本發明的一種快速篩選和制備香料的方法，將現有的體外細胞毒性檢測法和提取分離技術組合，用于快速篩選和制備香料；具體的步驟如下：?

a.用中性紅攝入法或MTT法對香料初浸膏進行體外細胞毒性檢測；?

b.根據細胞毒性檢測結果判斷香料初浸膏的細胞毒性：?

根據細胞相對增殖率RGR進行細胞毒性分級，當香料初浸膏的細胞毒性為0級和1級，該香料初浸膏樣品通過細胞毒性的初篩；?

當香料初浸膏的細胞毒性大于2級，則采用現有提取分離技術，用不同極性的溶劑，通過萃取技術，把香料初浸膏分成不同極性的提取物；或者采用不同極性的溶劑直接提取香原料，得到不同極性的提取物；或者采用超臨界流體技術對香原料萃取得到天然香料超臨界二氧化碳萃取物。?

c.?對各部分提取物分別進行體外細胞毒性檢測，找到細胞毒性的主要來源；通過現有提取分離技術，去除有毒部分，制備得到安全的香料。?

本發明的特點在于：?

1、采用體外細胞毒性試驗方法來篩選天然香料，符合3R原則，不使用動物，試驗周期為3天。與經典的急性經口毒性試驗相比，能有效的減少動物的使用量和飼養所需的人力物力，減輕活體動物的痛苦，縮短試驗周期，降低試驗成本，提高檢測效率；?

2、在細胞毒性測試技術的指導下，利用現代提取分離技術，找到細胞毒性的主要來源，并通過現有提取分離技術，得到安全可用的香料。?

3、該方法能夠降低香料的開發成本和開發周期。?

附圖說明：

附圖顯示靈香草浸膏不同溶劑萃取部分的中性紅細胞毒性試驗結果。?

具體實施方式：

以下是本發明的實施例，但本發明的內容并不局限于此。?

實施例一：?

1實驗部分?

1.1??儀器與材料?