[發明專利]從原料乳中分離β-乳球蛋白的方法

無效

• 申請號: 201210231797.7
• 申請日: 2012-07-04
• 公開（公告）號: CN102746395A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 劉建新;任大喜;繆淑穎
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/20
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明涉及的是一種β-乳球蛋白的分離純化方法，具體地說是一種從新鮮牛乳中高效分離和純化β-乳球蛋白的方法。

背景技術

β-乳球蛋白存在于大多數哺乳動物的乳中，是由乳腺上皮細胞合成的乳特有蛋白，在牛乳中濃度約為?3.2g/L，主要以二聚體的形式存在，2?個單體由非共價鍵連接。當?pH＜3.0?或pH＞7.0?時，β-乳球蛋白二聚體解離成單體。單體β-乳球蛋白分子量在?18300?道爾頓左右，等電點為5.1～5.3。β-乳球蛋白占乳清蛋白的55%左右，是乳清中的主要蛋白，是乳清蛋白的功能體現者。它具有改變牛乳熱穩定性、與脂肪酸及風味物質結合、抗癌等生物學活性以及良好的攪打起泡性、凝膠性、成膜性等加工特性，被廣泛應用于食品加工、化妝品、醫藥等領域。目前已有分離β-乳球蛋白的方法，例如親和層析、制備色譜、透析等，但處理量較小，儀器復雜、制備成本高。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種制備簡易、純度高，成本低的β-乳球蛋白。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種從原料乳中分離β-乳球蛋白的方法，包括如下步驟：

1）、將新鮮牛乳于3~5℃經離心和脫脂紗布過濾處理，從而除去乳脂肪，得首次濾液；

2）、首次濾液調節pH至4.5~4.7，室溫下靜置20~40min；得處理后首次濾液；

3）、將處理后首次濾液于3~5℃經離心和脫脂紗布過濾處理，所得的濾液重復上述3~5℃下的離心和脫脂紗布過濾處理，得二次濾液；

4）、二次濾液調節pH至1.9~2.1，得處理后二次濾液；

5）、先按照每1L處理后二次濾液添加65~75g氯化鈉的用量比在二次濾液中加入氯化鈉；然后再調節pH至1.9~2.1，接著室溫下靜置15~25min；

6）、將步驟5）所得物于3~5℃下經離心和脫脂紗布過濾處理，收集濾液；

7）、先按照每1L濾液（為步驟6）所得的濾液）添加220~240g氯化鈉的用量比在濾液中加入氯化鈉；然后再調節pH至1.9~2.1，接著室溫下靜置15~25min；

8）、將步驟7）的所得物于室溫下離心，將所得的沉淀溶解于PBS緩沖液（pH7.4）或蒸餾水中；

備注說明：PBS緩沖液（pH7.4）或蒸餾水的用量最少要求能溶解沉淀；一般而言，1000ml的新鮮牛乳作為原料配用100?ml左右的PBS緩沖液（pH7.4）或蒸餾水。

9）、室溫下，將步驟8）所得的溶液用截留分子量10000的濾膜進行超濾2~8小時；所得的截留液經凍干，得凍干β-乳球蛋白粉末。

作為本發明的從原料乳中分離β-乳球蛋白的方法的改進：

將凍干β-乳球蛋白粉末進行提純：用C8反相鍵合硅膠色譜柱、以乙睛-水為流動相進行梯度洗脫；214nm波長檢測，分別得A型β-乳球蛋白和B型β-乳球蛋白。

作為本發明的從原料乳中分離β-乳球蛋白的方法的進一步改進：

步驟1）為：將新鮮牛乳以3500~4500g，3~5℃，離心25~35min，4層脫脂紗布過濾；

步驟3）為：將處理后首次濾液于3~5℃，4500~5500g下離心15~25?min，4層脫脂紗布過濾；

步驟6）為：將步驟5）所得物于3~5℃，8000~12000g下離心15~25min，4層脫脂紗布過濾；

步驟8）為：將步驟7）的所得物于室溫下9000~11000g?離心15~25min。

作為本發明的從原料乳中分離β-乳球蛋白的方法的進一步改進：

步驟2）、步驟4）中均用0.8~1.2?M?的鹽酸調節pH值；

步驟5）和步驟7）均用1.8~2.2M的?鹽酸調節pH值。

作為本發明的從原料乳中分離β-乳球蛋白的方法的進一步改進：

步驟9）中的凍干為：于-40℃~-50℃下將截留液凍干至恒重。

本發明的從原料乳中分離β-乳球蛋白的方法，是將牛乳經離心脫脂后，經過調解pH、鹽析獲得β-乳球蛋白溶液，用超濾脫鹽濃縮后凍干，獲得β-乳球蛋白凍干粉；采用高效液相色譜法檢測，β-乳球蛋白凍干粉純度大于95%。

將本發明所得的凍干β-乳球蛋白粉末從分子量角度鑒定蛋白：采用12-20%濃度十二烷基磺酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），考馬斯亮藍染色，以標準品對照，確定目標蛋白子分子量為18.2kD。