[發明專利]棉大卷葉螟吐絲基因片段及其克隆方法和應用

無效

• 申請號: 201210231786.9
• 申請日: 2012-07-05
• 公開（公告）號: CN102719442A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 楊益眾;王中陽;蘇宏華;梁國華;陳春霞;陳小軍;周勇
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;A01H5/00
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及棉大卷葉螟絲素輕鏈蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列，并涉及該基因的用途。

背景技術

棉大卷葉螟（Sylepta?derogata?Fabricius）是一種分布極廣且寄主廣泛的多食性害蟲。屬鱗翅目螟蛾科，曾是棉田中重要的食葉性害蟲，大發生時，卷食棉葉，影響棉花的結鈴和最終產量。由于有機磷殺蟲劑的大量使用，該蟲的為害漸輕。但近些年隨著轉基因棉花的大面積種植，化學殺蟲劑用量的大幅度下降等原因，棉大卷葉螟在一些棉田的種群數量呈現上升趨勢，為害日漸嚴重，甚至造成整株葉片卷曲或被食光，棉株僅留下枝、莖，嚴重影響棉花的現蕾開花及最后的產量，成為近幾年我國長江中下游棉區棉花上較為重要的食葉性害蟲。

棉大卷葉螟在5月上、中旬平均氣溫達20℃時開始化蛹羽化。一、二代主要在木槿、苘麻等植物上繁殖為害，第三代開始遷移到棉田。8月中旬至9月下旬是棉大卷葉螟為害棉田的盛期，也是棉花受害最嚴重的時期。

棉大卷葉螟具有很強的繁殖能力，每頭雌蛾平均產卵180～260粒，最高達400粒，卵大多數散產于棉葉背面，以葉脈邊緣分布較多。幼蟲多在下午及夜間孵化，幼蟲歷期約為25天，初孵幼蟲喜歡群集在葉片背面取食葉肉，留下表皮；進入2、3齡以后開始分散吐絲，將棉葉卷成喇叭狀，并躲藏于卷葉內取食。大發生時，一張棉葉可被卷成2～3個喇叭筒，一般一個卷筒內僅有1頭幼蟲，且喜轉移危害。在食源充足時棉大卷葉螟幼蟲常不食光被卷的葉片即轉移，食源匱乏或蟲量較大時整株葉片被卷曲，大發生時葉片可被全部食光。

由于棉大卷葉螟有吐絲卷葉為害的特性，普通農藥對棉大卷葉螟的防治效果不甚理想，使得棉大卷葉螟的為害逐年加重。因此，能克隆到與卷葉螟吐絲相關的基因序列，對棉大卷葉螟的防治有重要的現實意義。

發明內容

本發明的目的在于闡明了昆蟲絲腺泌絲因子的一種基因序列、氨基酸序列。

本發明根據以往報道的外米綴蛾和大蠟螟輕鏈基因序列，設計引物，采用同源基因克隆策略和PCR技術，擴增中間片段，再根據測序結果，設計3’和5’引物，使用RACE法，分別擴增出3’和5’區段，測定序列后拼接成完整的基因序列，再使用ORF?Finder分析得到棉大卷葉螟絲素蛋白基因輕鏈基因部分的開放閱讀框。

本發明所述的棉大卷葉螟絲素輕鏈基因序列如SEQ?ID?NO.1所示；該基因cDNA全長1087bp，自46bp至849bp區段為其開放閱讀框，編碼267個氨基酸(SEQ?ID?NO.2)，5’非編碼區長45個堿基，3’非編碼區長238個氨基酸，有多聚核苷酸尾巴。

由上述基因碼蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

所述的棉大卷葉螟絲腺中的輕鏈基因序列，可在減輕棉大卷葉螟的吐絲卷葉危害中得到應用。

所述的棉大卷葉螟絲腺中的輕鏈基因序列，可在靶標作物中導入該基因，作為轉基因素材。

所述的棉大卷葉螟絲腺中的輕鏈基因序列，可作為其它眾多農林吐絲害蟲目的基因的參考。

附圖說明

圖1是中間產物PCR檢測結果；

圖2是中間片段膠回收結果；

圖3是菌液PCR檢測結果；

圖4是3’RacePCR檢測結果；

圖5是3’Race膠回收結果；

圖6是3’Race菌液PCR檢測結果；

圖7是5’RacePCR檢測結果；

圖8是5’Race膠回收結果；

圖9是5’Race菌液PCR檢測結果；

圖10是RT-PCR擴增結果；

圖11是酶切后結果的檢測；

圖12是CTE927-1表達SDS-PAGE圖像；

圖13是CTE927-1SDS-PAGE圖像；

圖14是CTE927-1轉膜后SDS-PAGE圖；

圖15是CTE927-1PVDF膜圖像。

圖1－9中M為DL2000DNA分子量標準。

具體實施方式

實施例一

1、Total?RNA的提取

RNA的提取使用的是Promega公司的SV?Total?RNA?Isolation?System試劑盒，具體方法如下：

1）在一個無菌小離心管中加入1mL的RNA?Lysis?Buffer(加BME)。