[發(fā)明專利]一種人心肌肌鈣蛋白I適配子及篩選方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210227783.8
• 申請(qǐng)日: 2012-07-03
• 公開（公告）號(hào): CN102703455A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張娟琨;劉珺;蔣樹海;徐錦鋒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/115
• 分類號(hào): C12N15/115;C12N15/10;C12Q1/68;C07K14/47
• 代理公司: 天津盛理知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 王來(lái)佳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人心肌肌鈣蛋白I適配子，尤其是一種人心肌肌鈣蛋白I適配子及篩選方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

急性心肌梗死(AMI)是我國(guó)病死率很高的心血管疾病之一，其早期診斷和及時(shí)治療是降低死亡率的關(guān)鍵。心肌肌鈣蛋白I以其高度的靈敏性和組織器官特異性及較長(zhǎng)的診斷窗口期在AMI和其他心臟疾病的診斷中顯示出其特殊的優(yōu)越性，并將其作為急性心肌梗死檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

核酸適配子是一類近年來(lái)出現(xiàn)的生物分子人工配體，通過(guò)體外篩選技術(shù)從大容量的單鏈寡核苷酸文庫(kù)中篩選出高親和力及特異性的心肌肌鈣蛋白I適配子，將其與電化學(xué)技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建心肌肌鈣蛋白I適配子傳感器，為急性心肌梗死的早期診斷奠定基礎(chǔ)。因此，急需大量能與心肌肌鈣蛋白I特異性結(jié)合且具有高親和力及特異性的心肌肌鈣蛋白I適配子。

目前，SELEX技術(shù)是一種新的組合化學(xué)技術(shù)，雖然也可以通過(guò)該技術(shù)進(jìn)行篩選獲得心肌肌鈣蛋白I適配子，但是目前一般SELEX篩選循環(huán)數(shù)為8-15輪，輪數(shù)太少，得不到高親和力的適配子，輪數(shù)太多，浪費(fèi)人力、物力及時(shí)間。

通過(guò)檢索，發(fā)現(xiàn)一篇與本發(fā)明申請(qǐng)相關(guān)的如下專利公開文獻(xiàn)：

人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子及應(yīng)用（CN1974594A），該發(fā)明公開了具有三種核苷酸序列的人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，該種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子可以在心肌肌鈣蛋白I早期檢測(cè)和臨床心肌損傷的診斷上應(yīng)用或用于心肌肌鈣蛋白I的分離純化，本發(fā)明人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子是寡核苷酸，分子量較小，可以化學(xué)合成，成本低；具有比抗體更高的親和性和特異性；便于標(biāo)記且可以在不同部位有選擇性的標(biāo)記；重復(fù)性和穩(wěn)定性好，且易于保存，即對(duì)高溫和劇烈條件不敏感，因此，具有良好的應(yīng)用前景。

通過(guò)對(duì)比，本發(fā)明申請(qǐng)與上述專利公開文獻(xiàn)有本質(zhì)的不同。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種人心肌肌鈣蛋白I適配子及篩選方法和應(yīng)用，該心肌肌鈣蛋白I適配子能與心肌肌鈣蛋白I特異性結(jié)合，具有高親和力及特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，該心肌肌鈣蛋白I適配子的篩選方法進(jìn)行12輪篩選即可得到足量和高純度的ssDNA文庫(kù)，得到高親和力的適配子，輪數(shù)較少、節(jié)約了人力、物力及時(shí)間。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案是：

一種人心肌肌鈣蛋白I適配子，具有序列表中SEQ?ID?No.1所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ?ID?No.2所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ?ID?No.3所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ?ID?No.4所述的核苷酸序列。

而且，所述SEQ?ID?No.1所述的核苷酸序列具有下述結(jié)構(gòu)：

所述SEQ?ID?No.2所述的核苷酸序列具有下述結(jié)構(gòu)：

所述SEQ?ID?No.3所述的核苷酸序列具有下述結(jié)構(gòu)：

所述SEQ?ID?No.4所述的核苷酸序列具有下述結(jié)構(gòu)：

一種人心肌肌鈣蛋白I適配子的篩選方法，步驟如下：

⑴合成隨機(jī)ssDNA文庫(kù)

合成長(zhǎng)度為81bp的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)，兩端為固定序列，中間19個(gè)堿基為隨機(jī)序列；

P81庫(kù)：5'-CGG?GAA?TTC?TAT?GGC?GGA?TGG?GAG?CGAN19GCC?GCA?AGA?AAA?AGT?TTG?AGA?GCAAGC?TTC?CG-3′。

其中：上游引物為：序列5；下游引物為：序列6；

⑵人心肌肌鈣蛋白I適配子的篩選

將人心肌肌鈣蛋白I按照表1中的量包被，包被液為pH9.6，0.05mol/LNaHCO₃，于4℃過(guò)夜，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔，其樣品孔和空白對(duì)照孔均加入50μL3%BSA封閉2h，4℃過(guò)夜；

將合成的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)配制成濃度為100μmol/L的溶液；將200μL結(jié)合緩沖液與隨機(jī)ssDNA文庫(kù)按照表1中的文庫(kù)量進(jìn)行混合，在90℃下加熱變性5min后，迅速置于冰上10min，然后室溫變性15min；

再將已變性的ssDNA先與由3%BSA封閉的空白對(duì)照孔結(jié)合，37℃孵育，然后轉(zhuǎn)移到人心肌肌鈣蛋白I包被孔與人心肌肌鈣蛋白I結(jié)合，37℃孵育40min，反篩除去與BSA結(jié)合ssDNA；

用洗滌緩沖液洗滌，洗去未結(jié)合心肌肌鈣蛋白I的ssDNA；