[發(fā)明專利]一種人心肌肌鈣蛋白I適配子及篩選方法和應(yīng)用無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201210227783.8 | 申請日： | 2012-07-03 |
| 公開（公告）號： | CN102703455A | 公開（公告）日： | 2012-10-03 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 張娟琨;劉珺;蔣樹海;徐錦鋒 | 申請（專利權(quán)）人： | 天津科技大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/115 | 分類號： | C12N15/115;C12N15/10;C12Q1/68;C07K14/47 |
| 代理公司： | 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209 | 代理人： | 王來佳 |
| 地址： | 300457 天津市濱海新*** | 國省代碼： | 天津;12 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 人心 肌鈣蛋白 配子 篩選 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種人心肌肌鈣蛋白I適配子，其特征在于：具有序列表中SEQ?ID?No.1所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ?ID?No.2所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ?ID?No.3所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ?ID?No.4所述的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人心肌肌鈣蛋白I適配子，其特征在于：所述SEQ?ID?No.1所述的核苷酸序列具有下述結(jié)構(gòu)：
所述SEQ?ID?No.2所述的核苷酸序列具有下述結(jié)構(gòu)：
所述SEQ?ID?No.3所述的核苷酸序列具有下述結(jié)構(gòu)：
所述SEQ?ID?No.4所述的核苷酸序列具有下述結(jié)構(gòu)：
3.一種如權(quán)利要求1所述的人心肌肌鈣蛋白I適配子的篩選方法，其特征在于：步驟如下：
⑴合成隨機(jī)ssDNA文庫
合成長度為81bp的隨機(jī)ssDNA文庫，兩端為固定序列，中間19個(gè)堿基為隨機(jī)序列；
P81庫：5'-CGG?GAA?TTCTAT?GGC?GGA?TGG?GAG?CGAN19GCC?GCA?AGA?AAAAGT?TTG?AGA?GCAAGC?TTC?CG-3′。
其中：上游引物為：序列5；下游引物為：序列6；
⑵人心肌肌鈣蛋白I適配子的篩選
將人心肌肌鈣蛋白I按照表1中的量包被，包被液為pH9.6，0.05mol/LNaHCO3，于4℃過夜，同時(shí)設(shè)空白對照孔，其樣品孔和空白對照孔均加入50μL3%BSA封閉2h，4℃過夜；
將合成的隨機(jī)ssDNA文庫配制成濃度為100μmol/L的溶液；將200μL結(jié)合緩沖液與隨機(jī)ssDNA文庫按照表1中的文庫量進(jìn)行混合，在90℃下加熱變性5min后，迅速置于冰上10min，然后室溫變性15min；
再將已變性的ssDNA先與由3%BSA封閉的空白對照孔結(jié)合，37℃孵育，然后轉(zhuǎn)移到人心肌肌鈣蛋白I包被孔與人心肌肌鈣蛋白I結(jié)合，37℃孵育40min，反篩除去與BSA結(jié)合ssDNA；
用洗滌緩沖液洗滌，洗去未結(jié)合心肌肌鈣蛋白I的ssDNA；
在人心肌肌鈣蛋白I與ssDNA結(jié)合的孔中加入洗脫緩沖液，80℃下培養(yǎng)10min，洗脫下與人心肌肌鈣蛋白I結(jié)合的ssDNA；
向洗脫液中加入等體積的酚：氯仿抽提，震蕩混勻后4℃、10000rpm離心5min，吸上清，向上清中加入2倍上清液體積的無水乙醇沉淀ssDNA，4℃、10000rpm離心5min，棄去上清，用1mL70%乙醇洗滌沉淀，37℃倒置烘干；
將沉淀溶解于20μL?TE緩沖液中，貯存于-20℃，作為PCR反應(yīng)的模板；
⑶PCR擴(kuò)增單鏈DNA過程
PCR擴(kuò)增引物：上游引物：序列5；下游引物：序列6；
擴(kuò)增模板為步驟⑵中洗脫純化的ssDNA，其擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；然后，94℃變性45s，60℃退火30s，72℃延伸40s，12個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸7min；
反應(yīng)體系25μL：ssDNA模板1μL，10×PCR?Buffer2.5μL，MgCl21.5μL，10mM的dNTPs2.5μL，10pmo?l的上、下游引物各2μL，，Taq酶0.2μL，滅菌雙蒸水13.3μL；
⑷不對稱PCR制備ssDNA次級文庫
上游引物：序列7；下游引物：序列8；上游引物：下游引物的比例為80：1；
擴(kuò)增模板為步驟⑶中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；然后，94℃變性45s，60℃退火30s，72℃延伸40s，40個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸7min；
反應(yīng)體系25μL：ssDNA模板1μL，10×PCR?Buffer2.5μL，MgCl21.5μL，10mM的dNTPs2.5μL，10pmol的上游引物和下游引物的量共為4μL，Taq酶0.2μL，滅菌雙蒸水13.3μL；
表1心肌肌鈣蛋白I蛋白適配子的12輪篩選的參數(shù)
4.權(quán)利要求1或2所述的人心肌肌鈣蛋白I適配子在心肌肌鈣蛋白I早期檢測和臨床心肌損傷的診斷上的應(yīng)用或應(yīng)用于心肌肌鈣蛋白I的分離純化。
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