[發明專利]一種細菌生物膜研究模型

無效

• 申請號: 201210222025.7
• 申請日: 2012-06-29
• 公開（公告）號: CN103509781A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 馬小軍;宋慧一;于煒婷
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/08;C12N11/04;C12Q1/02;C12R1/19;C12R1/385;C12R1/225;C12R1/07;C12R1/445;C12R1/46
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及一種細菌生物膜研究模型，具體地說是一種具有細菌生物膜功能，并可研究細菌生物膜生長特性的模型。

背景技術

在自然界、某些工業生產環境以及人和動物的體內外，絕大多數細菌是附著在有生命或無生命物體的表面，以生物膜（biofilm）的方式生長[Costerton?J.W.,LewandowskiZ.,Caldwell?D.E.,KorberD.R.,Lappin-Scott?H.M.,Microbial?biofilms,Annual?Review?ofMicrobiology,1995,49:711-745.]。細菌生物膜是指附著于生命或無生命物體表面被細菌胞外大分子包裹的有組織的細菌群體[O'TooleG.A.,Kaplan?H.B.,Kolter?R.,Biofilm?formation?asmicrobialdevelopment,Annual?Review?of?Microbiology,2000,54:49-79]。生物膜中水分含量可高達97％，除了水和細菌外，生物膜還含有細菌分泌的大分子多聚物、吸附的營養物質和代謝產物及細菌裂解產物等。生物膜的形成會使各種管道發生嚴重腐蝕，水質變差；致病菌在硬組織和醫療器械表面形成的生物膜往往導致感染，而感染增強了細菌的耐藥性和對宿主免疫應答的抵御[Jesaitis?AJ,Franklin?MJ,Berglund?D,et?al,Compromised?host?defense?on?Pseudomonasaeruginosa?biofilms:characterization?of?neut?rophil?andbiofilm?interactions,J.Immunol,2003,171(8):4329-4339]；形成生物膜的細菌對高溫、高滲、強酸等脅迫環境的抗性也明顯提高[Latha?Sabikhi,R.Babu,D.K.Thompkinson,Suman?Kapila,Resistance?of?Mi?croencapsulated?Lactobacillus?acidophilus?LA1to?Processing?Treatments?and?Simulated?Gut?Conditions,FoodBioprocess?Technol,2010,3:586-593]。研究發現，與浮游狀態同一細菌相比，生物膜細菌的基因表達、信號傳導和代謝特點均會有明顯不同[An?D,Parsek?MR,The?promise?and?peril?oftranscriptional??profiling??in?biofilm?communities,Curr?OpinMicrobiol,2007,10(3):292-6]。所以，如何在體外環境模擬生物膜狀態及制備生物膜成為了生物膜研究的一個重要方向。

目前體外構建生物膜的方法多數是采用將菌懸液涂于載玻片上，或細胞培養板中靜置培養得到生物膜。此種方法得到的生物膜不易控制，制備量少，不能滿足大量使用的需求。此外，細菌在生物膜內的生長呈現三維生長模式，而目前方法不能完全模擬細菌在生物膜內的這種生長方式。

發明內容

針對上述問題，本發明提出一種生物膜模型。其優點是可按需要作不同菌株組合，模型內細胞經過生長繁殖，形成生物膜，細胞密度高，細胞狀態與天然生物膜中細胞狀態相似。微囊膜主要成分為多糖類物質，與生物膜成分相近。

技術方案：

本發明的技術方案是提供一種用于體外研究細菌生物膜的三維模型，其特征在于，具體步驟為：

A：按10⁶-10⁸CFU/mL海藻酸鈉的初始接種量將微生物細胞混懸在海藻酸鈉溶液（0.1-50g/L）中，制備海藻酸鹽微球，稱之為A微球。其中，海藻酸鹽微球的制備方法包括靜電液滴法、銳孔擠出法、乳化-外部凝膠化法、乳化-內部凝膠化法或膜乳化法；

B：將上述水凝膠微球浸入聚陽離子溶液中，微球與聚陽離子溶液體積比為1:1~1:40，反應1-60分鐘，此時得到海藻酸鈉-聚陽離子微膠囊。取出用生理鹽水洗滌2-3次，稱之為B微球；

C：將第二步中的B微球浸入金屬螯合劑溶液中，液化微膠囊內部的海藻酸鹽凝膠。參與液化反應的有機金屬螯合劑溶液為40-70mmol/L的檸檬酸鈉或50-200mmol/L的EDTA。微膠囊與有機金屬螯合劑溶液體積比范圍為1:1-1:40，反應1-60分鐘，取出用生理鹽水洗滌，此時得到內部液態核心的微膠囊，稱之為C微球；