[發明專利]HIV-1 LTR上順式元件突變的真核細胞系統及其制備方法與應用

無效

• 申請號: 201210209034.2
• 申請日: 2012-06-21
• 公開（公告）號: CN103509754A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 朱煥章;林師冠;孔垂瑾;曲喜英
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12Q1/02
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 祝蓮君;雷芳

技術領域

本發明涉及生物技術領域。具體地說，本發明涉及一種HIV-1LTR上的順式元件突變的真核細胞系統及其制備方法和應用，所述真核細胞系統可用于HIV-1的治療藥物篩選與信號通路機制研究。?

背景技術

HIV-1基因表達極其依賴于宿主細胞內的轉錄因子[1]。HIV-1潛伏感染的一個重要分子機制就是相關轉錄因子的缺乏[2]。這是由于在靜止CD4+T細胞中，細胞處于靜止狀態，細胞內部處于一種轉錄因子相對缺乏的情況。整合在宿主基因組里面的HIV原病毒可以被包括TCR信號，細胞因子(IL-1β，IL-7，TNF-α等)，以及有絲分裂原(PMA，prostratin等)在內的多種T細胞活化信號激活[3]。這些信號最終驅動HIV轉錄是通過活化的細胞轉錄因子的誘導[3]。這些轉錄因子包括NF-κB和AP1，它們能夠結合到HIV?LTR內的增強子序列。除此之外，病毒也會產生一些轉錄調控蛋白來調控自身基因的轉錄。例如，在轉錄調控方面很最重要的TAT蛋白(反式轉錄激活因子，transactivator?oftranscription，TAT)。它由人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因編碼，通過與反式激活應答(transactivating?response，TAR)RNA序列結合以起始基因轉錄。HIV轉錄時TAR先轉錄形成一小段有著頸環結構的RNA。TAT可以結合到這段TAR轉錄形成的RNA，從而募集轉錄復合體的一些重要因子，從而保證HIV轉錄的順利進行[4]，抑制TAT的表達能夠誘導潛伏[1]。?

通過HIV?LTR上順式元件突變的細胞模型，可以有效進行藥物篩選和信號通路研究。Hung-Chih?Yang等利用缺失κB位點的NL4-3LTR啟動的Luc報告質粒篩選到轉錄因子Ets的一個突變型，ΔVII-Ets-1，其能夠有效地激活靜止CD4+T細胞中的HIV-1[5]。Samuel?A.Williams等也通過野生型以及一些轉錄因子結合位點突變的LTR的Luc報告質粒來研究Prostratin激活潛伏HIV-1表達的信號通路機制[6]。?

但是上述瞬時轉染細胞模型存在著很多缺陷，例如，細胞不能傳代，不同?批次實驗之間可能存在較大誤差等。因此本領域急需建立能夠傳代，而且實驗之間誤差較低的細胞模型，從而能夠進行藥物篩選與信號通路機制研究。?

發明內容

本發明的目的是提供一種HIV-1LTR上順式元件突變的真核細胞系統。?

本發明的另一目的是提供上述真核細胞系統的制備方法。?

本發明還有一目的是提供上述真核細胞系統在篩選HIV-1治療藥物中的應用。?

本發明還有一目的是提供篩選篩選HIV?1表達激活劑的方法。?

本發明還有一目的是提供包含野生型HIV?1LTR和報告基因，或突變型HIV?1LTR和報告基因的質粒。?

本發明還有一目的是提供整合有突變型HIV?1LTR和報告基因，從而穩定表達整合的所述報告基因的真核細胞。?

在第一方面，本發明提供一種真核細胞系統，所述真核細胞系統包括以下細胞：?

(a)基因組中整合有野生型HIV?1LTR和報告基因，從而穩定表達整合的報告基因的真核細胞；和?

(b)基因組中整合有突變型HIV?1LTR和報告基因，從而穩定表達整合的報告基因的真核細胞。?

在具體的實施方式中，所述報告基因包括GFP、LacZ。?

在另一具體實施方式中，所述突變型/野生型LTR和報告基因相鄰排列，LTR元件可操作地連接于報告基因。?

在另一具體實施方式中，LTR和報告基因構成的LTR-Luc元件是具有選自下組的核苷酸序列：?

(i)所述野生型HIV?1LTR和報告基因，包括SEQ?ID?NO：1所示HIV?LTR和Luc報告基因；?

(ii)所述突變型HIV?1LTR和報告基因，包括SEQ?ID?NO：2所示HIVLTRΔκB和Luc報告基因，SEQ?ID?NO：3所示HIV?LTRΔTAR0和Luc報告基因或SEQ?ID?NO：4所示HIV?LTRΔAP1和Luc報告基因。?

在具體的實施方式中，所述整合有野生型HIV?1LTR和報告基因的真核細胞是將野生型HIV?1LTR和報告基因插入pCDNA3.0載體得到的重組質粒轉染真核細胞得到的，所述整合有突變型HIV?1LTR和報告基因的真核細胞是將突變型HIV?1LTR和報告基因插入pCDNA3.0載體得到的重組質粒轉染真核細胞得到的。?