[發明專利]一種提取梨果實蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶及其活性測定方法

無效

• 申請號: 201210204587.9
• 申請日: 2012-06-19
• 公開（公告）號: CN102747055A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 吳俊;楊志軍;張紹鈴;齊開杰;陶書田;吳巨友
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12Q1/48
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

技術領域

本發明屬于植物生理學領域，涉及一種提取梨果實蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶及其活性測定方法。

背景技術

梨果實中的可溶性糖是直接影響果實品質的關鍵因素，在果實品質風味的形成中有著重要的作用，因而成為衡量果實品質優劣的重要標準之一。梨果實中糖分主要有蔗糖，葡萄糖，果糖，山梨醇等。果實中糖分的積累跟果實中糖代謝酶有著密切的關系，尤其是蔗糖代謝酶中的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶。在蔗糖積累的庫組織中，蔗糖磷酸合成酶對蔗糖的積累有著重要的作用，梨、桃、橙、甜瓜、香蕉等果實中蔗糖磷酸合成酶活性的上升有利于蔗糖的積累；而蔗糖合酶催化蔗糖形成果糖的反應是可逆的，分解方向形成的果糖為果實的形態建構提供物質基礎，同時也是呼吸作用的能量來源，蔗糖合酶合成方向的活性能夠通過保持蔗糖的濃度，進一步影響果實中糖分的積累。因此，準確測定蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的活性對于準確了解糖分的積累特征有著重要作用，同時有利于了解糖風味形成的生理機制。

目前，國內外有測定梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的方法報道，但是，由于處理方法的不科學性，應用范圍的局限性，造成轉化酶活性的測定不準確或低效，按照已經發表的方法步驟甚至無法測定出相應酶的活性。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種提取梨果實蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法。

本發明的另一目的是提供一種梨果實蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的測定方法。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

一種提取梨果實中蔗糖合酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）的方法，其特征在于準確稱取梨果肉，放入預冷的研缽中，冰浴下研磨，加入提取緩沖液，充分勻漿后，0～4℃條件下180000～20000g離心30～40min，取上清液，逐漸加入硫酸銨至80%的飽和度，靜置20～30min后，0～4℃條件下180000～20000g離心20～30min，去除上清液，加入脫鹽緩沖液重新溶解沉淀，再用D27mm透析袋透析脫鹽得蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，所述的提取緩沖液配方為200mmol·L^-1Hepes-NaOH,5mmol·L^-1MgCl₂,0.1%β-巰基乙醇（體積百分比，下同），0.05%Triton-X?100,0.05%BSA（質量體積百分比，g/100ml,下同），2%PVPP（質量百分比，下同）,1mmol·L^-1EDTA,1mmol·L^-1EGTA,10mmol·L^-1抗壞血酸鈉,10mM半胱氨酸-鹽酸，2%甘油（體積百分比，下同），pH?7.5；提取緩沖液與梨果肉的體積質量比是3～10ml：1g；所述的脫鹽緩沖液的配方為20mmol·L^-1Hepes-NaOH，0.25mmol·L^-1MgCl₂，1mmol·L^-1EDTA,1mmol·L^-1EGTA，0.01%β-巰基乙醇，0.05%BSA，0.2%甘油，pH?7.5；脫鹽緩沖液與梨果肉的體積質量比是1～5ml：1g；所述的透析使用的透析液為稀釋10倍的不含PVPP的提取緩沖液。

所述的梨果實中蔗糖轉化酶的整個提取過程在0～4℃的條件下進行。

所述的提取緩沖液與梨果肉的體積質量比優選5ml：1g。

所述的脫鹽緩沖液與梨果肉的體積質量比優選3ml：1g。

所述的透析時間優選6～10小時，進一步優選8小時。

一種測定梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的方法，包括如下步驟：

（1）按照上述的方法提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶；

（2）蔗糖合酶（分解方向）活性的測定：在490μL的反應液中加入490μL的脫鹽后的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，30℃反應30min后，加入490μL的DNS,準確沸水浴5min，冷卻后至室溫，在波長540nm下測定OD₅₄₀值，對照為不含底物的反應液；通過制定果糖標準曲線即可計算相應酶的活性；所述的反應液配方為80mmol·L^-1Mes緩沖液，5mmol·L^-1NaF，100mmol·L^-1蔗糖，5mmol·L^-1UDP,pH?5.5。

一種測定梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的方法，包括如下步驟：