[發明專利]一種提取梨果實蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶及其活性測定方法

無效

• 申請號: 201210204587.9
• 申請日: 2012-06-19
• 公開（公告）號: CN102747055A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 吳俊;楊志軍;張紹鈴;齊開杰;陶書田;吳巨友
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12Q1/48
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

1.一種提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于稱取梨果肉，放入預冷的研缽中，冰浴下研磨，加入提取緩沖液，充分勻漿后，0～4℃條件下180000～20000g離心30～40min，取上清液，逐漸加入硫酸銨至80％的飽和度，靜置20～30min后，0～4℃條件下180000～20000g離心20～30min，去除上清液，加入脫鹽緩沖液重新溶解沉淀，再用D27mm透析袋透析脫鹽得蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，所述的提取緩沖液配方為200mmol·L^-1Hepes-NaOH,5mmol·L^-1MgCl₂，0.1％β-巰基乙醇，0.05％Triton-X?100,0.05％BSA，2％PVPP，1mmol·L^-1EDTA，1mmol·L^-1EGTA，10mmol·L^-1抗壞血酸鈉，10mM半胱氨酸-鹽酸，2％甘油，pH?7.5；提取緩沖液與梨果肉的體積質量比是3～10ml：1g；所述的脫鹽緩沖液的配方為20mmol·L^-1Hepes-NaOH，0.25mmol·L^-1MgCl₂，1mmol·L^-1EDTA，1mmol·L^-1EGTA，0.01％β-巰基乙醇，0.05％BSA，0.2％甘油，pH?7.5；脫鹽緩沖液與梨果肉的體積質量比是1～5ml：1g；所述的透析使用的透析液為稀釋10倍的不含PVPP的提取緩沖液。

2.根據權利要求1所述的提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于所述的梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的整個提取過程在0～4℃的條件下進行。

3.根據權利要求1所述的提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于所述的提取緩沖液與梨果肉的體積質量比是5ml：1g。

4.根據權利要求1所述的提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于所述的脫鹽緩沖液與梨果肉的體積質量比是3ml：1g。

5.根據權利要求1所述的提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于所述的透析時間為6～10小時，優選8小時。

6.一種測定梨果實中分解方向的蔗糖合酶活性的方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）按照權利要求1所述的方法提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶；

（2）分解方向蔗糖合酶活性的測定：在490μL的反應液中加入490μL權利要求1提取的脫鹽后的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，30℃反應30min后，加入490μL的DNS，沸水浴5min，冷卻后測定OD₅₄₀值，對照為不含底物的反應液；通過制定果糖標準曲線即可計算相應酶的活性；所述的反應液配方為80mmol·L^-1Mes緩沖液，5mmol·L^-1NaF，100mmol·L^-1蔗糖，5mmol·L^-1UDP，pH?5.5。

7.一種測定梨果實中合成方向蔗糖合酶活性的方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）按照權利要求1所述的方法提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶；

（2）合成方向蔗糖合酶活性的測定：在50μL的反應液中加入50μL權利要求1提取的脫鹽?后的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，34℃反應1h后加入0.2mL的30％KOH，沸水浴10min終止反應，冷卻至室溫，加入3mL蒽酮溶液，40℃溫浴20min，冷卻至室溫后測定OD₆₂₀值。對照為不含底物的反應液；再通過制定蔗糖標準曲線即可計算相應酶的活性；所述的反應液配方為0.1mmol·L^-1磷酸緩沖液4mmol·L^-1UDP-葡萄糖，0.06mmol·L^-1果糖，15mmol·L^-1MgCl₂,pH?8.0；所述的蒽酮溶液為0.15g的蒽酮溶于100mL81％硫酸中制得。

8.一種測定梨果實中蔗糖磷酸合成酶活性的方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）按照權利要求1所述的方法提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶；

（2）蔗糖磷酸合成酶活性測定：在50μL的反應液中加入50μL脫鹽后的酶液，34℃反應1h后加入0.2mL的30％KOH，準確沸水浴10min終止反應，冷卻至室溫，加入3mL蒽酮溶液，40℃溫浴30min，冷卻至室溫后測定OD₆₂₀值。對照為不含底物的反應液；再通過制定蔗糖標準曲線即可計算相應酶的活性；所述的反應液配方為0.1mol·L^-1硼酸緩沖液，10mmol·L^-1UDP-葡萄糖，5mmol·L^-1果糖-6-磷酸，15mmol·L^-1葡萄糖-6-磷酸，15mmol·L^-1MgCl₂,1mMEDTA；所述的蒽酮溶液為0.15g的蒽酮溶于100mL81％硫酸中制得。?