[發明專利]一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的實現方法及其應用

無效

• 申請號: 201210203358.5
• 申請日: 2012-06-20
• 公開（公告）號: CN102899395A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 黃金明;王秀革;袁金鐸;王長法;鞠志花;李秋玲;齊超;張燕;李榮嶺;李建斌;侯明海;仲躋峰
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院奶牛研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;A01K67/027
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法，其特征在于通過實時熒光定量RT-qPCR和同位素標記相對和絕對定量iTRAQ的方法提供一個奶牛乳腺炎易感/抗性A2M候選基因；通過反轉錄RT-PCR和克隆測序分析可變剪切，同時通過基因直接測序技術檢測到該基因的單核苷酸多態性SNPs，利用軟件分析可變剪切和SNPs的關系，同時對體細胞評分SCS和A2M基因型進行關聯分析，判斷SNPs位點為功能性位點，選擇有利的等位基因型個體作為奶牛抗乳腺炎能力留種。

2.一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法，其特征在于其步驟是：

a：篩選A2M基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因，a1：對A2M?mRNA進行熒光定量PCR，記錄結果，a2：利用同位素標記相對和絕對定量iTRAQ的方法對A2M蛋白進行相對定量，記錄結果；

b：利用反轉錄RT-PCR擴增產物電泳及克隆測序分析可變剪切；

c：A2M基因的功能性SNP位點鑒別；

d：SNPs和可變剪切關系的分析。

3.根據權利要求2所述的一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法，其特征在于a：篩選A2M基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因，

a1：對A2M?mRNA進行熒光定量PCR步驟是：

首先分別選擇3頭正常的和3頭患乳腺炎的乳腺組織，利用PremixEx?TaqTM?II(大連寶生物工程公司，中國)和480?II(Roche?Diagnostics)儀器進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)，基因的相對表達水平用持家基因β-actin(序列號：NM_173979.3)做內參，實驗重復三次；

20μl?RT-qPCR擴增體系：10.0μlPremix?Ex?TaqTM?II(2×)，0.4μM上下游引物：

A2M-F：SEQ?ID?NO.1，A2M-R：SEQ?ID?NO.2；

或

β-actinF：SEQ?ID?NO.3，β-actin-R：SEQ?ID?NO.4；

2.0μl?A2M?cDNA(＜100ng)

或

β-actin質粒DNA，6.4μl蒸餾水；

擴增反應條件：94℃5min；然后94℃15s，56℃15s，這一步共40個循環；最后70℃5s，

分析熒光定量的結果，比較A2M?mRNA在患乳腺炎奶牛的乳腺組織中的表達量和正常的乳腺組織中的表達量；

a2：利用同位素標記相對和絕對定量iTRAQ的方法對A2M蛋白進行相對定量步驟是：

利用同位素標記相對和絕對定量iTRAQ的方法對3頭正常的和3頭患乳腺炎的乳腺組織A2M蛋白進行相對定量，牛的蛋白參考數據庫為UniProt?ID：Q9H0H5，iTRAQ的結果比較患乳腺炎組織A2M蛋白表達量和正常的組織表達量；

b：利用反轉錄RT-PCR擴增產物電泳及克隆測序分析可變剪切的步驟是：

以奶牛乳腺組織提取的cDNA為模板，根據A2M基因cDNA序列(NCBI參考序列：NM_001109795.1)設計特異引物擴增A2M?cDNA片段，特異引物上游引物A2MF序列為：SEQ?ID?NO.9，下游引物A2MR序列為：SEQ?IDNO.10，

25μl?PCR體系反應成分包括：DNA(100ng/μl)1μl，A2MF，A2MR引物(10μmol/L)各0.5μl，2×Taq?PCR?MasterMix(北京諾維森生物公司)12.5μl，重餾水補至25μl，

PCR程序為：94℃4min，然后94℃30s，64.9℃30s，72℃30s，共35個循環，72℃10min，

PCR產物用1％的瓊脂糖凝膠電泳，結果發現除了4623bp?PCR目的帶外，還有4條清晰的帶，對這4條帶純化后連接到載體，測序后發現2種新的可變剪切形式，標記為A2M-AS1和A2M-AS2；

c：A2M基因的功能性SNP位點鑒別步驟是：

根據引起基因可變剪切機制的相關背景資料，參考NCBI中牛A2M基因序列(序列號：NC_007303.4)，以奶牛DNA為模板，設計F1/R1和F2/R2引物擴增發生可變剪切位置附近的DNA序列：

引物序列F1為：SEQ?ID?NO.5；R1為：SEQ?ID?NO.6；

引物序列F2為：SEQ?ID?NO.7；R2為：SEQ?ID?NO.8；

25μl?PCR體系，PCR反應，然后對產物直接測序，使用DNAStar軟件包中的SeqMan軟件分析測序結果，在A2M基因的29和37外顯子上發現了兩個SNPs位點：c.3535A＞T和c.4520T＞C(NCBI參考序列：NM_001109795.1)；其中，c.3535A＞T是位于擴增片段SEQ?ID?NO.12第642bp處的單核苷酸位點；c.4520T＞C位于擴增片段SEQ?ID?NO.14第526bp處的單核苷酸位點，

選擇A2M基因序列上鑒別到的2個SNPs位點在338頭中國荷斯坦奶牛個體中采用直接測序的方法進行SNP基因分型，采用SAS8.1軟件進行關聯性分析，通過關聯性分析結果，分別發現這2個位點的AA和TT基因型型具有比較高的SCS，根據這2個基因型和SCS的表型有關，篩選出乳腺炎抗性/易感功能性分子標記，通過對奶牛個體基因型的判定，通過標記輔助選擇的方法，可選育乳腺炎抗性個體，培育出抗乳腺炎的奶牛新品系；

d：SNPs和可變剪切關系的分析：

為了分析測序發現的SNPs和可變剪切的關系，利用ESEfinder3.0對這2個SNP進行分析，發現這兩個SNP正好是位于剪切增強子內ESE，其中，c.3535A＞T突變增加了SC35?and?SRp40兩種剪切蛋白的結合，c.4520T＞C突變增加了SRp40剪切蛋白的結合，

同時對奶牛DNA進行測序，并且提取它們相應的總RNA，利用RT-PCR和克隆測序技術分析c.3535和c.4520位點的基因型和異常可變剪切體的關系。