[發明專利]一種專門針對環境樣品內分泌干擾效應的測試方法

無效

• 申請號: 201210199433.5
• 申請日: 2012-06-18
• 公開（公告）號: CN103509849A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 魏東斌;趙慧敏;杜宇國
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34;C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種專門針對環境樣品內分泌干擾效應的無代謝活化(-S9)雙雜交酵母實驗方法，屬于環境污染檢測和評價技術范疇。

背景技術

隨著工農業生產的快速發展，環境污染對人類造成的危害遠遠超過預想的程度，其中，環境污染物的內分泌干擾效應受到越來越廣泛的關注。內分泌干擾效應，是指由污染物引起的對生物體內分泌系統或與內分泌相關系統的干擾損害。有關內分泌干擾效應的研究主要是從細胞、亞器官或器官及組織等水平，揭示污染物對生態系統的生物種群、群落或生態系統的影響機制。內分泌干擾效應的測試和評價方法也在不斷開發、優化。目前，檢測環境雌激素效應的方法多為生物測試法，包括雌激素受體重組酵母實驗、子宮增重實驗、細胞增殖實驗、卵黃蛋白原誘導實驗等。其中，重組酵母實驗體系是近年研究、應用較多的方法之一。該實驗采用聚合酶鏈反應法擴增人雌激素受體基因hER，通過構建誘餌質粒，提取、純化含有hER共激活因子基因的靶質粒，將誘餌質粒和靶質粒同時轉染酵母細胞構建hER雙雜交酵母。當具有雌激素效應的受試物作用于重組酵母時，可與雌激素受體形成復合物，促進報告基因LacZ的表達，產生β-半乳糖苷酶，通過測定β-半乳糖苷酶的活性反映受試物的雌激素效應。

在傳統的無代謝活化(-S9)雙雜交酵母實驗操作中，待測樣品在暴露環節中其濃度被稀釋到原始樣品濃度的1/200，很難準確測定其內分泌干擾效應。為了得到準確的毒性測試結果，往往需要配置濃度很高的樣品儲備液。由于很多化學物質的水溶性較差，配制高濃度溶液往往需要添加有毒的助溶劑，如二甲基亞砜DMSO，由于生物毒性實驗對助溶劑DMSO的含量要求不能超過0.1％，否則容易引起假陽性結果。對于環境樣品而言，一般是通過提高樣品濃縮倍數才能進行內分泌干擾效應測試。為得到高濃縮倍數的待測樣品，需要采集大量環境樣品，給采樣帶來困難；另外，環境樣品往往需要復雜的固相萃取等濃縮富集操作，如果濃縮倍數過高，往往很難保證其準確性。因此，有必要開發一種專門針對環境樣品的簡便、準確的內分泌干擾效應測試方法，以降低采樣和樣品制備的成本，提高測試結果的準確性。

發明內容

本發明的目的是為克服無代謝活化(-S9)雙雜交酵母實驗體系中待測樣品濃度稀釋倍數過大、要求環境樣品濃縮倍數過高等缺點，為化學污染物和環境樣品無代謝活化(-S9)酵母雙雜交實驗測試方法的推廣開辟一條新途徑。

本發明的目的通過以下方式實現：通過調整培養基的組分及其含量，調整受試重組酵母細胞的培養時間和溫度，提高酵母細胞暴露密度，使其懸濁液在600nm處吸光度達0.5-2.5。在此基礎上，調整暴露實驗過程中酵母細胞懸濁液和待測環境樣品的添加體積，在保證測試結果準確的前提下，待測環境樣品在暴露環節僅稀釋2倍，大大降低了采樣體積和樣品前處理的成本。

本發明的優點主要體現在以下幾個方面：(1)降低環境樣品前處理過程中的濃縮倍數，省去樣品高倍濃縮的步驟，減少了采樣量，降低了采樣和樣品前處理的成本。(2)環境樣品的暴露濃度稀釋為原樣品濃度的1/2，使環境樣品的檢測更方便。

附圖附表說明

圖1.本發明實施例雌二醇劑量-效應曲線

具體實施方式

實施例：

將0.02毫升凍存的酵母細胞株轉接入盛有20毫升培養基的錐形瓶中，于30℃振蕩培養12小時，稀釋懸濁液，至600nm處吸光度(OD₆₀₀)為2.5。移取稀釋后的酵母懸濁液0.90毫升、培養基0.10毫升、不同濃度的雌二醇溶液1.00毫升，至容積為5毫升的玻璃離心管中，混勻。從離心管中移取0.20毫升溶液至96孔板中，500轉/分、30℃培養4小時，之后立即測定600nm處的吸光度值(OD₆₀₀)。從96孔板中吸走0.15毫升溶液，再加入0.12毫升緩沖溶液、0.02毫升氯仿，800轉/分、30℃培養10分鐘。隨后加入鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)溶液0.04毫升，800轉/分培養1小時。再加入0.10毫升碳酸鈉(Na₂CO₃)溶液，30℃、800轉/分培養10分鐘。測定420nm處吸光度(OD₄₂₀)。

用以下公式計算β-半乳糖苷酶活性U：