[發明專利]一種白藜蘆醇生物轉化菌種篩選、菌種鑒定及利用該菌種進行白藜蘆醇生物轉化的方法

有效

• 申請號: 201210188784.6
• 申請日: 2012-06-11
• 公開（公告）號: CN102703331A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 陳雪香;曹庸;李赟
• 申請（專利權）人: 曹庸
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02;C12Q1/68;C12Q1/04;C12P7/22;C12R1/80
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種白藜蘆醇生物轉化菌種的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)取打碎的虎杖置于燒杯中，向其中加入去離子水，料液重量體積比為1g/2ml，靜置24h，得虎杖浸出液；

2)取富集培養基分裝至若干個三角燒瓶中，分別標號并加入虎杖浸出液20μL，封口于28℃、避光、200r/min下震蕩培養4d后，采用TLC方法檢測，得出轉化效率最高的培養液；

3)將轉化效率最高的培養液于篩選培養基上做梯度稀釋涂板，于28℃下培養，然后觀察是否有能形成水解圈的菌種長出，挑出單菌落重復操作，48h后觀察水解圈形成情況；

4)取水解圈培養基，用甲醇提取，水解圈培養基/甲醇＝1g/10ml，稀釋后進行TLC分析，并對白藜蘆醇生成的提取物進行HPLC分析，觀察白藜蘆醇生成情況，根據得到的水解圈及白藜蘆醇生成情況得到具有高轉化能力的菌種S-4。

2.根據權利要求1所述的白藜蘆醇生物轉化菌種的篩選方法，其特征在于，步驟2)中，所述富集培養基的制備方法是，稱取硝酸鈉0.3g，磷酸氫二鉀0.1g，MgSO₄·7H₂O0.05g，氯化鐘0.05g，硫酸亞鐵0.001g于容量瓶，蒸餾水定容至100mL，即得基礎培養基；使用前稱無菌白藜蘆醇苷100mg加入已滅菌基礎培養基中，制得富集培養基。

3.根據權利要求1所述的白藜蘆醇生物轉化菌種的篩選方法，其特征在于，步驟3)中，所述篩選培養基的制備方法是，稱取硝酸鈉0.3g，磷酸氫二鉀0.1g，MgSO₄·7H₂O0.05g，氯化鉀0.05g，硫酸亞鐵0.001g于容量瓶，蒸餾水定容至100mL，即得基礎培養基；在基礎培養基中添加基礎培養基重量1.5％的瓊脂固定，使用前加熱溶解，冷卻至50℃時稱取無菌白藜蘆醇苷100mg加入其中，充分混勻，即得篩選培養基。

4.根據權利要求2或3所述的白藜蘆醇生物轉化菌種的篩選方法，其特征在于，所述無菌白藜蘆醇苷是在無菌工作環境下將白藜蘆醇苷加入無菌乙醇中，自然揮干所得，白藜蘆醇苷∶無菌乙醇＝0.5g∶10ml。

5.一種白藜蘆醇生物轉化菌種的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)菌種的形態學觀察，將PDA固體培養，察氏固體培養基倒平板，冷凝后用接種鉤挑取菌絲少許，點接于平板，30℃培養箱中倒置培養48h以上，觀察菌落形成的過程和形態；

2)用水浸片法制片，在干凈的載波片中央滴加一滴乳酸石炭酸藍棉液，用解剖針從菌落邊緣劃取菌絲體一小塊，放入乳酸石炭酸藍棉液中，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌株的菌絲有無橫隔、足細胞，觀察孢子的形狀大小和著生方式及其孢子梗；

3)參照真菌提取試劑盒附帶提取方法操作提取菌種基因組DNA，配制好PCR擴增體系，然后在PCR儀上進行擴增，完成后經1％瓊脂糖凝膠電泳后，觀察與拍攝結果；

4)將得到的菌株ITS序列用GenBank中的Blast程序與數據庫中的其它菌株進行比較分析，得出相似性。

6.一種利用如權利要求所述的方法篩選的菌種進行白藜蘆醇生物轉化的方法，包括以下步驟：

1)取打碎的虎杖置于燒杯中，向其中加入去離子，料液重量體積比為1g/2ml，靜置16-24h得虎杖浸出液；

2)另取PDA培養基裝容器中，加入虎杖浸出液，封口，得虎杖苷溶液；

3)將菌液加入虎杖苷溶液中，菌液和虎杖苷溶液的體積比為0.5∶1，封口于28℃、避光、200r/min下震蕩培養4d。